= ГАМЕТОГЕНЕЗ
УДК 591.3:597.5
РОЛЬ ОВОДНЕНИЯ В ОВУЛЯЦИИ ООЦИТОВ ТРАВЯНОЙ ЛЯГУШКИ IN VITRO
© 2013 г. М. Н. Скоблина
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: skoblina38@mail.ru Поступила в редакцию 23.03.12 г.
Окончательный вариант получен 21.11.12 г.
В процессе стимуляции овуляции ооцитов травяной лягушки Rana temporaria экстрактом гомологичных гипофизов происходит увеличение их объема. Воздействия, подавляющие оводнение ооцитов костистых рыб (раствор Рингера без ионов калия и ингибитор №+,К+-АТФазы — оубаин), а также ингибиторы аквапоринов (хлористая ртуть и метилметанетиосульфонат) приводят к тому, что объем окруженных фолликулярными оболочками ооцитов травяной лягушки под влиянием экстракта гомологичных гипофизов не увеличивается, а процент овулировавших ооцитов снижается. Объем ооцитов, лишенных фолликулярных оболочек, не меняется при созревании под действием прогестерона, на него не влияет ни одна из использованных обработок. Полученные данные позволяют предполагать, что в процессе стимуляции овуляции ооцитов травяной лягушки происходит их оводнение, необходимое для овуляции, оно не происходит в отсутствии клеток фолликулярной оболочки.
Ключевые слова: ооцит, фолликул, созревание, овуляция, оводнение, аквапорины, оуабаин, хлористая ртуть, метилметанетиосульфонат, амфибии.
DOI: 10.7868/S0475145013030075
Для превращения овариального ооцита в способное к оплодотворению яйцо необходимо, чтобы он созрел (произошла дезинтеграция оболочки ядра — "зародышевого пузырька" (ЗП), прошли деления созревания, "созрела" цитоплазма) и ову-лировал, т.е. освободился от оболочек, окружавших его в яичнике.
У ряда видов амфибий и костистых рыб механизм гормональной регуляции процессов созревания довольно хорошо изучен. Показано, что под влиянием гонадотропных гормонов гипофиза в фолликулярных клетках, окружающих ооцит, синтезируется стероид, который, действуя на ооцит, запускает процессы созревания (Masui, Clarke, 1979; Nagahama, 1990). Для видов, используемых в лаборатории, известны условия, в которых ооцит созревает in vitro под влиянием гонадотропинов или стероидов. Однако воспроизведение in vitro процесса овуляции сталкивается с большими трудностями. Созревшие in vitro ооциты зачастую не овулируют.
Созревание ооцитов костистых рыб сопровождается увеличением объема ооцита, вызванным оводнением. Оводнение рассматривается как процесс, обеспечивающий достаточную плавучесть выметанной икре, особенно пелагической (Wal-
lace, Selman, 1978; Cerda et al., 2007). Однако есть данные и об оводнении ооцитов морских рыб, откладывающих донную икру (Craik, Harvey, 1987), и пресноводных рыб (Hirose, 1976). С одной стороны, считается, что оводнение ооцитов костистых рыб в процессе созревания является уникальным явлением среди позвоночных (Wallace, Selman, 1978; Cerda et al., 2007), с другой — высказывается предположение о том, что оводнение ооцитов может играть роль в механизме овуляции (Hirose, 1976; Milla et al., 2006). Если предположение о роли оводнения в овуляции ооцитов справедливо, возникает вопрос, не является ли процесс оводнения ооцитов более универсальным, чем это принято считать, не может ли он участвовать в механизме овуляции ооцитов не только у костистых рыб, но и у других низших позвоночных? В литературе есть данные об увеличении объема (Mild, Lovtrup, 1985) и веса овулировывших ооцитов травяной лягушки (Руднева, 1968, цитировано по Детлаф, 1977), но предположений о связи этого процесса с овуляцией не высказывается. Если для овуляции ооцитов низших позвоночных дей-ствительно необходимо оводнение, то не может ли отсутствие овуляции при ее стимуляции in vitro быть связано с нарушением этого процесса?
287
5*
Хирозе (Hirose, 1976) предположил, что в механизме оводнения ооцитов костистых рыб существенную роль играет поступление в ооцит неорганических ионов. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что оводнение ооцитов подавляется воздействиями, препятствующими их накоплению: средой, не содержащей ионы калия (Wallace et al., 1992), и подавлением Ма+-К+-АТФазы и натриевых каналов (LaFleur, Thomas, 1991). Установлено также, что оводнение ооцитов фундулюса обыкновенного (Fundulus het-eroclitus) (McPherson et al., 1989) и японского речного угря (Anguillajaponica) (Kagawa et al., 2009) не происходит в отсутствие фолликулярных клеток. В последнее время показано, что в оводнении ооци-тов костистых рыб участвуют аквапориновые водные каналы (АП), обеспечивающие пассивное поступление воды в клетку по осмотическому градиенту (Arge et al., 2002). Их участие в оводнении ооцитов обнаружено у дорады (Sparus auratus) (Fabra et al., 2005, 2006), японского речного угря (Kagawa et al., 2009) и пресноводного обыкновенного мешкожаберного сома (Heteropneustes fossilis) (Chaube et al., 2011). Их проницаемость, как и проницаемость большинства водных каналов, подавляется соединениями ртути и частично восстанавливается Р-меркаптоэтанолом (Fabra et al., 2005; Kagawa et al., 2009; Chaube et al., 2011).
Мы хотели выяснить, происходит ли увеличение объема в процессе созревания и овуляции ооцитов травяной лягушки in vitro, и, если происходит, влияют ли на него воздействия, подавляющие оводнение ооцитов костистых рыб (среда без ионов К+, подавление Na+-K+-АТФазы, подавление аквапоринов). Для решения вопроса о том, играет ли увеличение объема какую-то роль в овуляции, мы сравнивали их влияние не только на объем ооцитов, но и на процент ооцитов, овулиро-вавших под влиянием экстракта гомологичных гипофизов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Опыты были проведены на фолликулах травяной лягушки Rana temporaria на протяжении трех сезонов, нумерация самок сплошная (первый сезон: самки 1—14, второй: самки 15—27, третий: самки: 28—31). Отловленных осенью самок содержали в контейнере с небольшим количеством воды в темноте при 4°C. Самок забивали декапитацией после выдерживания в 0.2% растворе MS-222. Яичники переносили в раствор Рингера для холоднокровных и разделяли отточенными пинцетами на фрагменты, содержащие 1—5 фолликулов. Фрагменты тщательно перемешивали и переносили в чашки Петри с 5 мл раствора (по 33 фолликула на чашку). Фолликулы выдерживали в растворе Рингера (контроль) или в растворе ингибитора в течение 2 ч. Затем и в опыт и контроль добавляли
экстракт гипофизов травяной лягушки (до конечной концентрации 0.005—0.0025 гип/мл). В опытах по изучению влияния ингибиторов водных каналов фолликулы после преинкубации в растворе Рингера с ингибиторами отмывали в трех сменах раствора Рингера (по 10 мл) и помещали в раствор Рингера с прогестероном (1 мкг/мл). В ряде случаев фолликулы инкубировали в растворе Рингера с прогестероном или экстрактом гипофизов в течение разного времени (см. табл. 5), затем обрабатывали хлористой ртутью, отмывали и переносили в раствор Рингера с прогестероном. Для стимуляции овуляции в опытах с хлористой ртутью через сутки добавляли простагландин F2a (2.5 мкг/мл).
Фолликулы инкубировали при 15—17°C, созревание и овуляцию ооцитов регистрировали через 48 ч после начала гормональной обработки. Каждый вариант опыта ставили в двух—четырех повторах. Критерием овуляции служило отсутствие на ооцитах фолликулярной оболочки, хорошо выявляемое под бинокулярным микроскопом. После учета овуляции ооциты фиксировали кипячением, разрезали лезвием безопасной бритвы и определяли процент созревших ооцитов по отсутствию ЗП.
Фолликулярные оболочки удаляли пинцетами после обработки фрагментов яичника бескальциевым раствором Рингера. Режим обработки фолликулов бескальциевым раствором Рингера и проверка полноты удаления фолликулярных клеток подробно описаны ранее (Скоблина, Кондратьева, 1983). В каждом варианте опыта в чашке Петри с 5 мл раствора культивировали по 15—20 "голых" ооцитов. Для стимуляции их созревания использовали прогестерон (1 мкг/мл).
При определении процента овуляции для различных экспериментальных групп рассчитывали среднюю и ошибку средней. Для оценки достоверности различий (р < 0.05) использовали критерий х2 для качественных показателей.
Измерение ооцитов и фолликулов обычно проводили через двое суток после начала гормональной обработки. Диаметры измеряли на их изображениях, полученных с помощью сканирования. В большинстве опытов сканировали 3—4 пробы в каждом варианте опыта и контроля на сканере Epson Perfection 4490 Photo. Была использована специальная компьютерная программа, которая обеспечивает автоматическое измерение двух диаметров ооцитов (наибольшего и перпендикулярного к нему) на изображениях, полученных для каждого экспериментального варианта, расчет объема каждого ооцита и определение среднего значения. Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя непараметрическую статистику — критерий Манна—Уитни—Уилкоксона для независимых выборок в программе SigmaPlot.
Таблица 1. Сравнение объемов исходных и овулировавших ооцитов
Дата опыта Номер самки 3 Объем, мм3 (M ± m) Разница в объеме исходных фолликулов и овулировавших ооцитов, %
исходных фолликулов овулировавших ооцитов
03/01 1 3.11 ± 0.15 (32) 3.21 ± 0.13 (34)*** 3.2
14/02 2 1.81 ± 0.11 (51) 1.86 ± 0.09 (31)* 2.8
14/02 3 2.16 ± 0.18 (24) 2.36 ± 0.14 (31)*** 8.5
21/02 4 2.27 ± 0.22 (68) 2.36 ± 0.09 (46)** 3.9
22/02 5 1.69 ± 0.05 (25) 1.77 ± 0.10 (99)* 4.5
04/03 6 2.00 ± 0.15 (97) 2.05 ± 0.13 (119) 2.1
14/03 7 1.89 ± 0.10 (83) 1.95 ± 0.01 (122)*** 3.0
18/03 8 1.73 ± 0.09 (83) 1.76 ± 0.09 (46) 1.8
29/03 9 1.18 ± 0.06 (148) 1.23 ± 0.06 (186)*** 4.3
29/03 10 1.62 ± 0.09 (154) 1.69 ± 0.07 (202)*** 3.4
29/3 11 1.60 ± 0.09 (61) 1.69 ± 0.06 (38)*** 3.8
05/04 12 2.05 ± 0.09 (50) 2.13 ± 0.12 (97)*** 3.7
11/04 13 2.09 ± 0.11 (71) 2.21 ± 0.09 (79)*** 5.5
18/04 14 2.07 ± 0.12 (95) 2.13 ± 0.096 (82)** 2.9
Здесь и далее в скобках приведено число измерений. Здесь и далее * Р < 0.05, ** <0.01, *** <0.001.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменение объема ооцитов на разных стадиях созревания
Измерения, проведенные на фолликулах 14 самок лягушки, показали, что объем исходных и созревших под влиянием экстракт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.