БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 41 - 58
УДК 576.32.36;582.282.23
РОЛЬ ПЕТЛИ L5—6, СОЕДИНЯЮЩЕЙ МЕМБРАННЫЕ СЕГМЕНТЫ M5 И M6, В БИОГЕНЕЗЕ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ Pmal Н+-АТРазы ДРОЖЖЕЙ*
© 2015 В.В. Петров
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290Пущино Московской обл., пр. Науки, 5; электронная почта: vpetrov07@gmail.com
Поступила в редакцию 26.05.14 После доработки 23.07.14
Экстрацитозольная петля L5—6 (714-DNSLDID) соединяет трансмембранные сегменты M5 и M6, вместе с сегментами M4 и M8 образующие сайты транспорта катионов в Н+-, Ca2+-, K+,Na+-, Н+,К+- и других Р2-АТРазах. Для изучения структурно-функциональной организации Pmal Н+-АТРазы плазматической мембраны дрожжей использовали аланин- и цистеин-сканирующий мутагенез. Замены на Ala и Cys наиболее консервативного остатка (Leu-717) вызывали полное блокирование биогенеза фермента, который не достигал секреторных везикул. Замена D714A приводила к уменьшению экспрессии фермента в 5 раз и потере его активности, замена D714C полностью блокировала биогенез фермента. Замены остальных аминокислотных остатков не приводили к потере активности фермента. Были произведены дополнительные замены Asp-714 и Asp-720 на Asn и Glu. Из замен остатка Asp-714 только D714N частично восстанавливала биогенез мутантного фермента и его функционирование; в то же время все мутации, полученные для Asp-720, обладали значительной экспрессией и были активны. Экспрессированные мутантные ферменты (34—95% от уровня дикого типа) обладали значительной активностью (35—108%) и были пригодны для детального анализа. У одного из этих мутантов (I719A) наблюдали трехкратное уменьшение экспрессии, активности и транспорта Н+ и его сопряжения с гидролизом ATP, однако замена I719C мало отличалась от дикого типа. Таким образом, в двух случаях из семи замены на Ala и Cys серьезно нарушали биогенез и/или функционирование фермента. Результаты позволяют предположить важную роль аминокислотных остатков, образующих петлю L5—6, отвечающую, видимо, за правильное расположение трансмембранных сегментов M5 и M6 и других доменов Pma1 Н+-АТРазы, в биогенезе и функционировании фермента и, возможно, участвующую в его регуляции.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дрожжи, плазматическая мембрана, секреторные везикулы, Pma1 Н+^ТРаза, экстрацитозольная петля, транспорт Н+, сайт-направленный мутагенез.
Н+-АТРаза плазматической мембраны дрожжей (Pmal), кодируемая геном PMA1 [1], является жизненно необходимым ферментом, генерирующим трансмембранный электрохимический градиент протонов, за счет энергии которого функционируют различные вторичные транспортные системы и поддерживается ионный го-меостаз и внутриклеточный рН. Pmal АТРаза относится к широко распространенной и физиологически важной группе Р2-АТРаз [2], входящих в семейство Р-АТРаз. Эти ионные насосы, присутствующие как в про-, так и в эукариоти-ческих клетках, используют энергию гидролиза АТР для транспорта различных катионов (Н+, Na+, K+, Cu+, Ag+, Mg2+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Cd2+, Zn2+, Pb2+, Mn2+) через клеточные и внутриклеточные мембраны [2, 3].
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-151, 28.12.2014.
Р2-АТРазы имеют одну главную каталитическую субъединицу, встроенную в липидный би-слой посредством четырех трансмембранных гидрофобных сегментов у N-концевой и шести сегментов у С-концевой частей фермента разной длины и наклона. Эти сегменты образуют мембранный домен фермента (М), в котором находятся аминокислотные остатки, участвующие в транспорте катионов. Они связаны между собой пятью относительно короткими экстрацитозоль-ными и четырьмя более длинными цитозольны-ми петлями, самые важные из которых — так называемые большая L4—5 (между сегментами М4 и М5) и малая L2—3 (между сегментами М2 и М3), образующие домены N (АТР- или нуклео-тид-связывающий, включающий среднюю часть большой петли L4—5), P (содержащий сайт фос-форилирования и включающий N- и С-концевые части этой петли) и А (действующий как «привод» или заякориватель, включающий N-конце-вую часть фермента и малую петлю L2—3) [4, 5].
Эти ферменты обладают общим каталитическим механизмом, при котором АТР связывается с консервативным остатком аспарагиновой кислоты, находящимся в петле Ь4-5, с образованием макроэргического фосфорилированно-го интермедиата [6]. Стехиометрия катионного транспорта, как и его специфичность, различаются у различных представителей этого семейства, варьируя от 1—2 Н+/АТР у протонных насосов плазматических мембран грибов и растений [7-9] до 2 Са2+/АТР и 3 №+/2 К+/АТР у Са2+- и Ма+,К+-АТРаз животных клеток [10]. Детерминанты катионной специфичности и стехиометрии транспорта находятся в сердцевине трансмембранных сегментов М4, М5, М6 и М8 этих ферментов, что было подтверждено рентгеноструктурным анализом Са2+- [4, 5] и №+,К+-АТРаз животных клеток [11, 12] и Н+-АТРаз грибов [13] и растений [14].
Ранее сайт-направленный мутагенез Са2+-[15-18] и №+,К+-АТРаз [18-21] животных клеток выявил аминокислотные остатки в сегментах М4, М5, М6 и М8, ответственные за транспорт катионов; мутагенез Н+-АТРазы плазматической мембраны дрожжей также обнаружил аминокислотные остатки в сегментах М4 [22], М5 [8, 23], М6 [8, 24, 25] и М8 [8, 9, 26, 27], замены которых нарушали нормальное функционирование фермента и/или его биогенез, в т.ч. изменяли сопряжение гидролиза АТР и транспорта Н+ [8, 9, 24-27]. Некоторые замены ключевых аминокислотных остатков в этих сегментах Р2-АТРаз (например, в М6 Са2+,Мп2+-АТРа-зы эндоплазматического ретикулума дрожжевой клетки) могут даже изменить специфичность катионного транспорта [28, 29]. Таким образом, и мембранная, и цитозольная части фермента детально изучались и изучаются [8, 9, 15-32], в то время как данные о роли аминокислотных остатков в экстрацитозольной части Р2-АТРаз малочисленны и относятся в основном к изучению Н+,К+- и Ма+,К+-АТРаз животных клеток [33-37]. В частности был проведен цистеин-сканирующий мутагенез трех экстрацитозоль-ных петель Ма+,К+-АТРазы [33-35], а для Н+,К+-АТРазы было установлено, что ингибиторы, подобные омепразолу, реагируют с остатком Суз в петле между сегментами М5 и М6 [37]. В Н+-АТРазе грибов изучалась только состоящая из двух аминокислотных остатков петля Ь1-2 с прилегающими частями сегментов М1 и М2 [38].
Во время реакционного цикла Р2-АТРазы претерпевают существенные конформационные изменения, фермент при связывании АТР и транспортируемых катионов обратимо переходит из состояния Е1 с высоким сродством к
субстрату (MgATP и транспортируемому катиону) и низким - к специфическому ингибитору ортованадату (аналогу продукта реакции орто-фосфата) в состояние Е2 с противоположными свойствами. При этом трансмембранные сегменты М1-М6, представляющие а-спирали, сгибаются, частично разворачиваются и даже выходят из мембраны, в то время как сегменты М7-М10 менее подвижны [5]. Ранее было показано, что замены аминокислотных остатков ^-концевой части М6 существенным образом влияли на биогенез и/или функционирование Рта1 АТРазы дрожжей [24, 25]. Т.к. связывающая сегменты М5 и М6 короткая петля Ь5-6 образует вместе с ними так называемую шпильку М5-М6 [39-41], логично предположить, что остатки, образующие петлю, могут играть важную роль в структурно-функциональной организации фермента.
Результаты, описанные в настоящей статье, являются продолжением систематического изучения Рта1 Н+-АТРазы плазматической мембраны дрожжей и сфокусированы на экстрацито-зольной петле Ь5-6, соединяющей С-концевую часть сегмента М5 и ^-концевую часть сегмента М6, с целью обнаружения аминокислотных остатков, которые могли бы играть роль в гидролизе АТР и транспорте протонов или других аспектах биогенеза и функционирования фермента.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штамм дрожжей. В работе использовали штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae SY4 (MATa; ura3-52; leu2-3, 112; his4-619; sec6-4; GAL;pma1::YIpGAL-PMA1) [42], в котором присутствовали хромосомная (PMA1) и плазмидная (pma1) копии гена, кодирующего Pmal Н+-АТРазу. В штамме SY4 хромосомная копия гена АТРазы дикого типа находилась под контролем промотора GAL1 (Pgal-PMA1), плазмидная (на цент-ромерной плазмиде YCp2HSE) — под контролем индуцируемого тепловым шоком промотора HSE (PHSE-pma1) [42], при этом сам плазмидный ген pma1 был или родительского типа, или мутант-ный. Штамм SY4 также содержал температурно-чувствительную мутацию в гене SEC6, блокирующую слияние секреторных везикул с плазматической мембраной при тепловом шоке и приводящую к накоплению секреторных везикул.
Сайт-направленный мутагенез. Для введения мутаций во фрагмент BglII-SalI (519 п.н.) гена pma1, который был предварительно субклони-рован в модифицированную версию плазмиды Bluescript («Stratagene», США), использовали набор для олигонуклеотид-направленного мута-
генеза («Amersham», США) или ПЦР [8, 9, 43]. По завершении мутагенеза фрагменты секвени-ровали для подтверждения наличия мутаций и отсутствия нежелательных замен других оснований. Затем этими фрагментами с помощью рестрикционных эндонуклеаз BglII, HindIII, SacI, Sali и Т4 ДНК-лигазы («New England Biolabs», США) последовательно замещали соответствующие участки в плазмиде pPMA1.2, несущей полную кодирующую последовательность гена pmal [42]. Для получения экспрессии Pmal Н+-АТРазы в секреторных везикулах фрагмент Hindlll-SacI (3,77 т.п.н.), содержавший кодирующую последовательность гена, с помощью рестрикционных эндонуклеаз HindIII и SacI и Т4 ДНК-лигазы переносили в центро-мерную плазмиду YCp2HSE под контроль промотора HSE (PHSE-pma1), которой (YCp2HSE-PMA1) трансформировали штамм SY4 [42].
Выделение секреторных везикул. Для получения секреторных везикул клетки штамма SY4 выращивали при 23° до середины логарифмической фазы роста (^600 ~0,7—1,0) на жидкой среде, содержавшей 0,67 г/л YNB («Difco», США), 20 мг/л гистидина и 2%-ную галактозу, а затем отмывали от среды с галактозой и переносили на среду, содержавшую 2%-ную глюкозу. Через 3 ч инкубации с глюкозой дрожжи подвергали тепловому шоку, повышая температуру до 39°,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.