ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 6, с. 942-951
УДК 581.1
РОЛЬ ПОСТУПЛЕНИЯ ВОДЫ В ПЕРЕХОДЕ РЕКАЛЬЦИТРАНТНЫХ СЕМЯН ОТ ПОКОЯ К ПРОРАСТАНИЮ
© 2004 г. Н. В. Обручева, О. В. Антипова
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 23.03.2004 г.
У рекальцитрантных семян конского каштана (Aesculus hippocastanum L.), сохраняющих зимой высокую влажность, покой определяется присутствием и влиянием кожуры, тогда как собственно осевые органы зародыша, извлеченные из этих семян, не нуждаются в периоде покоя. Такие осевые органы активно поглощают воду и способны быстро наращивать сырой вес, заметно превосходя его уровень в наклевывающихся целых семенах. В поглощении воды существенную роль играет накопление фруктозы как основного осмотически активного вещества. АБК препятствует поступлению воды в осевые органы и тем самым задерживает начало их роста. Сохранение ответной реакции на АБК в течение всего периода покоя указывает на присутствие функционирующих рецепторов АБК и системы передачи сигналов. Содержание эндогенной АБК в осевых органах в середине периода покоя семян удваивается, что совпадает с большей задержкой поступления воды в осевые органы в этот период. При выходе семян из покоя и набухании перед наклевыванием уровень АБК в осевых органах постепенно снижается. Экзогенная АБК имитирует состояние покоя, накладывая ограничение на поступление воды в осевые органы. Этот эффект АБК полностью снимается при обработке их фузикокцином А (ФК А). В осевых органах выходящих из покоя и прорастающих семян обнаружены эндогенные ФК-подобные лиганды, что позволяет предположить in situ стимуляцию эндогенным ФК поступления воды через активацию плазмалеммной Н+-АТФазы, подкисление клеточных стенок, их разрыхление и снижение тургора. ФК, по-видимому, может преодолевать ин-гибируемое АБК поступление воды на уровне регуляции активности Н+-АТФазы. Можно предположить, что в покоящихся интактных рекальцитрантных семенах осевые органы, сохраняющие высокую влажность, компетентны увеличить свою оводненность и начать подготовку к прорастанию под действием эндогенного ФК, когда ослабнет покой, наложенный кожурой.
Aesculus hippocastanum - покой семян - прорастание семян - осевые органы - оводненность - рост -АБК - фузикокцин - плазмалеммная Н+-АТФаза
Покой семян обычно определяют как неспособность семян прорасти, поскольку тестируют его именно по этому признаку. Действительно, находящиеся в покое семена не прорастают, будучи перенесены в благоприятные условия температуры и водоснабжения. Однако, при всей очевидности такого заключения, поиск механизмов покоя семян не следует ограничивать поиском механизмов репрессии или индукции ростовых процессов. Можно с уверенностью представить себе инициацию роста при раннем прорастании как процесс, запущенный повышением оводненности осевых органов, т.е. рассматривать поступающую в семена воду как триггер [1, 2]. Благодаря
Сокращения: ФК - фузикокцин; ФПЛ - ФК-подобные лиганды.
Адрес для корреспонденции: Обручева Наталья Владимировна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (095) 977-80-18; электронная почта: obroucheva@ippras.ru
поступлению воды в семена, в них последовательно достигаются критические уровни оводненности для всех процессов основного метаболизма, включая интенсификацию дыхания, а также начало синтеза мРНК и белков и начало распада запасных соединений (белков и крахмала) в осевых органах зародыша. Если для начала прорастания необходимо прежде всего поступление воды, то следует рассматривать покой семян как состояние, в котором осевые органы зародыша неспособны поглотить необходимое для прорастания количество воды, даже если, находясь в покое, они и не испытывают недостатка в доступной воде.
В данной статье состояние покоя семян рассматривается именно с позиций их неспособности увеличить свою оводненность до уровня, запускающего прорастание семян. Поскольку состояние покоя семян, наступающее еще при их созревании, связывают с временным повышением уровня свободной АБК, мы проанализировали действие АБК на покоящиеся и прорастающие семена. Для
такого рода исследований очень подходят семена конского каштана, поскольку они относятся к редкому для средней полосы типу семян - рекаль-цитрантным семенам. В отличие от многочисленных, так называемых ортодоксальных семян, которые переносят состояние покоя, будучи мало оводненными, рекальцитрантные семена, чтобы не погибнуть, должны сохранять высокую овод-ненность в течение периода покоя и прорастания. Семена конского каштана, хотя и имеют высокую влажность осевых органов, тем не менее, в состоянии покоя неспособны прорасти даже при перенесении их в оптимальные условия водоснабжения [3]. Рекальцитрантность таких семян обусловлена наличием плотной толстой кожуры, предохраняющей от потери воды, что вместе с тем определяет длительное состояние покоя интакт-ных семян. Осевые органы таких семян не имеют собственного покоя, т.е. после вычленения из семени и переноса в благоприятные условия они не только способны расти, но и превысить размеры, типичные для начальных стадий роста при естественном прорастании [4, 5]. Поскольку при этом в осевых органах протекает нормальный метаболизм белков, такие изолированные осевые органы могут служить удобной моделью при изучении явления покоя семян.
МЕТОДИКА
Зрелые опавшие семена конского каштана (Aesculus hippocastanum L.), собирали ежегодно в начале октября (1996-2003 гг.), помещали на холодную стратификацию во влажный песок при 4°С на 4 мес., т.е. до того времени, пока семена не начинали активно прорастать при этой температуре. В осевых органах таких семян, состоящих из корешка, гипокотиля и почечки, еженедельно определяли влажность и сырой вес, а также регулярно брали пробы на содержание фруктозы, эндогенной АБК и фузикокцин-подобных лигандов (ФПЛ).
Параллельно по ходу стратификации из семян регулярно извлекали скальпелем зародышевые оси и инкубировали их в течение нескольких дней в темноте при 27°С в чашках Петри в воде или в растворах 10-5 М АБК ("Fluka", Швейцария) и 10-6 М фузикокцина А (ФК А, получен из лаборатории Г.С. Муромцева в Институте с.-х. биотехнологии РАСХН) по отдельности или совместно (10-5 М АБК + 10-6 М ФК А). У изолированных зародышевых осей ежедневно измеряли длину и сырой вес.
Для определения АБК зародышевые оси фиксировали в жидком азоте, растирали и проводили экстракцию 80%-ным метанолом при 4°С в присутствии антиоксидантов (бутилированного гидро-кситолуола и аскорбиновой кислоты). Экстракт очищали, пропуская через колонку с сорбентом
Поролас-ТМ ("Омскхимпром") и выпаривали в токе азота при 40°С. Дальнейшую очистку проводили на колонке с поливинилполипирролидоном ("Sigma", США), последовательно соединенной с колонкой, содержавшей сорбент Amprep C-18 ("Amersham", Великобритания) по методу Котова и Котовой [6]. Через колонки пропускали водный экстракт, подкисленный до рН 3. Сорбированную на колонке АБК затем элюировали 40%-ным метанолом в 0.2 М уксусной кислоте и собирали для концентрирования в подсоединенный картридж с Поролас-ТМ. После элюирования 100%-ным метанолом раствор выпаривали в вакууме при 35°С. Содержание АБк измеряли иммунохимическим методом, как описано в [7].
Присутствие ФПЛ в осевых органах определяли после экстракции 96%-ным этанолом [8, 9]. Супернатант после центрифугирования 30 мин при 12000 g и 4°С упаривали, и из водного раствора хлороформом извлекали ФПЛ. После высушивания материал хранили при -20°С. Затем препарат растворяли 96%-ным метанолом и подвергали двукратному центрифугированию при 9000 g 30 мин. Супернатант после 30 мин экспозиции в метаноле осаждали при 70000 g 30 мин. Полученный супернатант фракционировали методом ВЭЖХ на хроматографе ("Gilson", Франция) с УФ-детектором [8, 9]. ФК-подобные соединения элюируются в линейном градиенте метанола (50100%; скорость протока 1 мл/мин) в 7-й фракции. Полученный раствор центрифугировали 20 мин при 10000 g и 4°С и супернатант использовали для радиоиммунного и радиорецепторного анализов, основанных на способности ФПЛ конкурировать с меченым [Н3]-дигидроФК за связывание с белками-рецепторами плазмалеммы в первом случае или с антителами к ФК - во втором [8, 9].
Для определения фруктозы изолированные осевые органы экстрагировали 82%-ным этанолом в течение суток при комнатной температуре. Экстракт центрифугировали 10 мин при 5000 g. Количественное определение фруктозы проводили методом Roe [10].
Данные обработаны статистически, и результаты представлены в виде среднего арифметического и его стандартной ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рекальцитрантность семян конского каштана проявляется в их способности поддерживать на высоком уровне влажность осевых органов в течение всего периода покоя (табл. 1), пока семена хранятся при 4°С во влажном песке. Такие семена приобретают способность прорастать при 4°С после четырех месяцев холодной стратификации, что сопровождается увеличением оводненности их осевых органов. Влажность осевых органов
Длительность набухания, ч
Рис. 1. Влажность осевых органов из целых семян конского каштана, инкубируемых в воде или АБК, после различных сроков стратификации. 1 - 9 нед., АБК, 10-4 М; 2 - 9 нед., вода; 3 - 14 нед., вода; 4 - 18 нед., вода. Стрелкой указано время накле-вывания 50% семян в воде. 50% семян, инкубируемых в АБК, наклевываются через 250-260 ч.
при наклевывании составляет 75.4 ± 0.5% от сырого веса. О поддержании оводненности в период покоя свидетельствует и постоянный сырой вес осевых органов - в среднем 50 мг/ось, что соответствует 63-64% влажности. Вес начинает увеличиваться после 15 нед. стратификации и достигает в среднем 100 мг/ось при наклевывании семян. Таким образом, при холодном хранении семена прорастают только при увеличении их сырого веса и влажности до критического уровня.
Если перенести семена в оптимальные условия, когда температура и наличие доступной воды
Таблица 1. Влажность осевых органов в покоящихся и наклюнувшихся семенах конского каштана
Длительность с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.