ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2012, № 3, с. 288-295
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 577.171.52:577.17.05
РОЛЬ СЕРОТОНИНА В СТАНОВЛЕНИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА
© 2012 г. В. И. Мельникова, М. С. Извольская, С. Н. Воронова, Л. А. Захарова
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: zakharova-l@mail.ru Поступила в редакцию 21.06.2011 г.
Исследована роль серотонина в регуляции развития и функционирования Т- и В-систем иммунитета в онтогенезе крыс после фармакологического подавления его синтеза у плодов. Показано, что пренатальный дефицит серотонина вызывает снижение массы тимуса и селезенки, изменения их клеточного состава, стойкие нарушения в развитии клеточного и гуморального иммунитета у половозрелых потомков. Совокупность полученных данных свидетельствует, что серотонин может являться одним из морфогенетических факторов в развитии иммунной системы.
Согласно современным представлениям, формирование нейроэндокринного контроля функций иммунной системы закладывается уже в пре-натальном онтогенезе и осуществляется на протяжении всей жизни (Besedovsky, del Rey, 1996; Захарова и др., 2000; Bellinger et al., 2008; Bilbo, Schwarz, 2009). Однако на разных этапах онтогенеза влияние нейроэндокринной системы на иммунную систему различно. В постнатальном периоде жизни многие медиаторы и гормоны ней-роэндокринной системы участвуют, в основном, в поддержании гомеостаза иммунной системы в ответ на изменения окружающей среды. Их эффекты на иммунную систему неспецифичны, кратковременны и обратимы. В раннем онтогенезе они являются индукторами развития, оказывая необратимое морфогенетическое влияние на плод, как в пределах центральной нервной системы, так и в периферических органах (Fowden, Forhead, 2004; Zakharova et al., 2005; Spencer et al., 2011).
Одним из регуляторов развития различных тканей плода является серотонин. Известно его участие в процессах гаструляции и нейруляции, морфогенетическое влияние на формирование лицевого черепа, сердца и физическое развитие у млекопитающих (Buznikov et al., 1999; Van Velzen, Toth, 2010). У половозрелых животных серотонин контролирует процессы дифференцировки Т-лим-фоцитов, активность Т-клеток-помощников, естественных клеток-киллеров, дендритных клеток и макрофагов (Cloöz-Tayarani, Changeux, 2007). Свои иммунотропные эффекты серотонин осуществляет через специфические рецепторы различных субтипов, экспрессированных на клетках иммунной системы (Cloöz-Tayarani, Changeux,
2007). К настоящему времени накоплено достаточное количество экспериментального материала, свидетельствующего о регуляторном влиянии серотонина на функционирование иммунной системы в постнатальный период. В то же время данные об его участии в раннем развитии иммунной системы отсутствуют.
В работе исследовано влияние пренатального дефицита серотонина на развитие и функционирование Т- и В-систем иммунитета в онтогенезе крыс. В качестве экспериментальной модели использовали фармакологическое подавление синтеза серотонина в пренатальном периоде с последующей оценкой численности и состава субпопуляций лимфоцитов, а также клеточного и гуморального иммунного ответа у постнатальных животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на крысах Вистар (питомник "Столбовая", РАН, Московская обл.). Беременных самок содержали в стандартных условиях. Для получения самок с датированным сроком беременности использовали 3-4-месячных крыс, к которым вечером подсаживали самцов, а утром брали влагалищные мазки. Учитывая, что у крыс покрытие происходит в 1—2 ч ночи, полагали, что в день обнаружения спермы в мазке возраст плодов составляет около 12 ч и, таким образом, этот день считали первыми сутками эмбрионального развития (Э1).
Беременным самкам крыс внутрибрюшинно (в/б) вводили пара-хлорофенилаланин (п-ХФА, Sigma, США) в дозе 100 мг/кг веса в 0.5 мл 0.9%-ного раствора NaCl в период с Э13 по Э17. Контроль-
ным животным вводили в/б 0.5 мл 0.9%-ного раствора NaCl. Функциональную активность Т-си-стемы иммунитета оценивали на Э21, 3-и (П3), 20-е (П20), 70-е (П70) и 90-е (П90) сут постна-тального развития. Функциональную активность В-системы иммунитета оценивали на П20 и П70. Анализ популяций лимфоцитов тимуса и селезенки проводили на П20 после подавления синтеза серотонина п-ХФА у плодов крыс.
В отдельных экспериментах п-ХФА вводили половозрелым 2-месячным самцам крыс также в/б, в дозе 100 мг/кг веса. Функциональную активность Т- и В-лимфоцитов оценивали через 1, 10 и 43 сут после инъекций.
Для подавления синтеза серотнина in vitro 1 мМ п-ХФА добавляли в культуру клеток тимуса и селезенки непосредственно перед культивированием. Предварительно из суспензии клеток селезенки удаляли тромбоциты, содержащие значительные количества серотонина. Суспензию клеток селезенки (5 мл) наслаивали на 5 мл Лимфолита М (Cederlane, Канада) и центрифугировали при 1000 g (20 мин). Фракцию, обогащенную лимфоцитами, собирали, дважды отмывали в среде 199 и центрифугировали (200 g, 10 мин).
Оценка пролиферативного иммунного ответа Т-лимфоцитов. Функциональную активность Т-лимфоцитов тимуса и селезенки оценивали по пролиферативному иммунному ответу, индуцированному митогеном конканавалином А (Кон А, 2.5 мкг/мл). Клетки тимуса (2 х 105 клеток на лунку в 200 мкл среды) инкубировали в среде RPMI-1640 (Serva, ФРГ), содержащей 10%-ную феталь-ную телячью сыворотку (Gibco, Великобритания), 2 мМ L-глютамина (ICN, Великобритания), 10 мМ Hepes-буфера (Serva), 50 мкг/мл гентами-цина (Gibco), в течение 72 ч в 5%-ном CO2, при 37°С в 96-луночных пластиковых планшетах (Costar, США). На последние 18 ч культивирования добавляли [3H] тимидин по 0.5 мкКи на лунку (60 Ки/мМ, Amersham, Великобритания). Для одной экспериментальной точки использовали пять лунок. После инкубации клетки переносили полуавтоматическим харвестером (Scatron, Норвегия) на стекловолокнистые фильтры (GF/C, Whatman, Великобритания). Радиоактивность образцов измеряли на сцинтилляционном счетчике Rack-beta (LKB, Швеция).
В экспериментах in vitro через 30 мин культивирования обогащенной лимфоцитами фракции с 1мМ п-ХФА добавляли Кон А (2.5 мкг/мл или 0.5 мкг/мл) и в соответствующие лунки — свежеприготовленный раствор серотонина в концентрациях от 10-3 до 10-7 М. Далее культивирование проводили выше описанным методом.
Оценка количества антителообразующих клеток. Функциональную активность В-системы
иммунитета оценивали по числу антителообразующих клеток (АОК) к эритроцитам барана в селезенке крыс после пренатального или постнаталь-ного подавления синтеза серотонина п-ХФА. Крыс иммунизировали в/б введением 0.5 мл 50% суспензии эритроцитов барана в 0.9%-ном растворе NaCl. Количество АОК в суспензии клеток селезенки определяли на 5-е сут после иммунизации крыс модифицированным методом Каннин-гхама (Cunningham, 1965).
Анализ состава клеточных популяций тимуса и селезенки. Тимус и селезенку взвешивали и получали суспензии клеток. Подсчет числа ядросодер-жащих клеток проводили в камере Горяева в присутствии 1.5%-ной уксусной кислоты. Процентное содержание популяций Т- и В-лимфоцитов в тимусе и селезенке определяли методом проточной цитометрии. В качестве маркера Т-лимфоци-тов использовали моноклональные антитела к CD90 антигену, конъюгированные с фикоэритри-ном (BD Pharmingen, США). В-лимфоциты идентифицировали с помощью антител к CD45RA антигену, конъюгированных с фикоэритрином (BD Pharmingen). Степень зрелости Т-лимфоцитов анализировали с помощью двойного мечения мо-ноклональными антителами к CD8b и к CD4 антигенам, конъюгированными с фикоэритрином и флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) соответственно (Cederlane). Иммуноцитохимическое ме-чение и последующий анализ клеток на цитомет-ре (Cell Lab Quanta SC, Beckman-Coulter, Германия) проводили в соответствии с методом, описанным ранее (Melnikova etal., 2010).
Статистическую обработку проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона, результаты представлены в виде среднего ± стандартная ошибка.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние пренатального дефицита серотонина на клеточный состав тимуса и селезенки. Введение п-ХФА плодам крыс на Э13—Э17 вызывало достоверное снижение массы тимуса и селезенки, а также уменьшение общего числа ядросодержа-щих клеток в этих органах на П20. Эти изменения были наиболее выражены в селезенке (таблица). В тимусе отмечалось незначительное, но статистически достоверное снижение процентного содержания зрелых Т-лимфоцитов CD4 или CD8 фенотипа и увеличение содержания незрелых Т-лимфоцитов (двойные позитивные клетки, экс-прессирующие одновременно CD4 и CD8 антигены) по сравнению с контрольными животными.
В селезенке после пренатального подавления синтеза серотонина п-ХФА наблюдалось достоверное увеличение процентного содержания В-лимфоцитов и снижение содержания Т-лим-
Клеточный состав тимуса и селезенки на 20-е сут постнатального развития у крыс после пренатального подавления синтеза серотонина
Показатель Тимус Селезенка
0.9%-ный NaCl n = 14 п-ХФА n = 14 0.9%-ный NaCl n = 14 п-ХФА n = 14
Масса органа, мг Число ядросодержащих клеток х 106/орган Число В-лимфоцитов, % Число Т-лимфоцитов, % Число CD4-положительных клеток, % Число CD8-положительных клеток, % Число двойных положительных клеток ^4+ и CD8+), % 149.25 ± 8.1 391.75 ± 10.82 4.63 ± 0.26 7.35 ± 0.28 84.87 ± 0.54 131.5 ± 5.31* 304 ± 13.28* 3.68 ± 0.27* 6.3 ± 0.26* 88.12 ± 0.11* 120.75 ± 7.88 60.25 ± 4.69 43.56 ± 1.82 32.5 ± 2.5 22.66 ± 0.75 12.02 ± 2.1 78.25 ± 3.28* 42 ± 3.58* 57.54 ± 3.21* 25.86 ± 2.73* 23.75 ± 2.4 10.64 ± 1.5
Примечание. п — число измерений, "—" — нет данных.
*р < 0.05 между группами, получавшими п-ХФА и 0.9%-ный №С1.
фоцитов в общей популяции лимфоцитов на П20. Достоверных различий в процентном содержании Т-лимфоцитов CD4 и CD8 фенотипа не выявлено (таблица).
g м 60000 но ит
де ил
ми к
В
40000
s g 20000
н
ем F >
2 S
лм g s 0
(а)
□ 2
Э21 П3 П20 П70 П90
ак но
S Eh
де ил
Я X
80000 г
60000
40000 -
20000 -
(б)
П3 П20 П70 П90
Возраст
Рис. 1. Пролиферативный и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.