НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 3, с. 202-210
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.892:577.352.5
РОЛЬ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА цАМФ В КРУГООБОРОТЕ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕРВНОГО
ОКОНЧАНИЯ ЛЯГУШКИ
© 2008 г. А. М. Петров*, А. Р. Гиниатуллин, А. Л. Зефиров
Казанский государственный медицинский университет
В экспериментах на нервно-мышечных препаратах лягушки с использованием электрофизиологического (двухэлектродной фиксации потенциала) и оптического (применение флуоресцентного эн-доцитозного красителя FM1-43) методов было обнаружено комплексное влияние системы циклического аденозинмонофата (цАМФ) на экзо-эндоцитозный цикл синаптических везикул при длительном высокочастотном раздражении (20 имп/с, 3 мин). На фоне активации цАМФ-зависимых энзимов (100мкМ 8-Вг-цАМФ, 50мкМ Ы2-цАМФ) наблюдалось облегчение экзоцитоза везикул готового к освобождению пула и усиление эндоцитоза синаптических везикул. В то же время нарушалось перемещение везикул мобилизационного пула в готовый к освобождению пул, а секреция медиатора поддерживалась везикулами резервного пула. При блокировании аденилатциклазы (1мкМ MDL) происходило угнетение экзоцитоза везикул готового к освобождению пула, затруднялось его пополнение везикулами мобилизационного и резервного пулов на фоне ослабления эндоцитоза. Таким образом, стимуляция цАМФ пути способствует поддержанию секреции медиатора при высокочастотной активности за счет везикул резервного пула и протеканию рециклирования по медленному пути, а фоновая активность аденилатциклазы необходима для эффективного протекания всех ключевых этапов везикулярного цикла.
Ключевые слова: экзоцитоз, эндоцитоз, рециклирование синаптических везикул, везикулярные пулы, цАМФ, токи концевой пластинки, FM1-43.
ВВЕДЕНИЕ
В пресинаптических нервных окончаниях (НО) химических синапсов присутствует большое количество синаптических везикул. Каждая везикула содержит определенное количество молекул медиатора (квант медиатора), которое при слиянии везикулы с мембраной НО (экзоцитозе) освобождается в синаптическую щель [1]. Экзоцитоз осуществляется в специализированных участках пресинаптической мембраны - активных зонах (АЗ) в ответ на вход Са2+ через потен-циалуправляемые каналы [2, 3]. После экзоцитоза везикулярная мембрана перемещается к участкам эндоцитоза, где происходит опосредованный клатрином и динамином захват мембранного фрагмента в НО [4]. Вновь образовавшиеся везикулы транспортируются вглубь нервного окончания, заполняются медиатором и могут повторно использоваться в освобождении медиатора. Процессы от экзоцитоза везикулы до приобретения ею повторной способности к экзоцитозу получили название рециклирования, а постоянный кругооборот везикул в НО называется везикулярным циклом [1, 2, 5]. Изменение динамики этих
*Адресат для корреспонденции: 420012, Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел.: (843) 2927299, факс: (843) 2360393; e-mail: fysio@rambler.ru
процессов лежит в основе пресинаптических форм пластичности, проявление которых зависит от степени активности НО [6, 7].
В НО сосуществуют несколько популяций везикул. Небольшая часть от общей популяции везикул прикреплена в области АЗ и может в ответ на Са2+ сигнал немедленно подвергаться экзоцитозу. Эта совокупность везикул обозначается как готовый к освобождению медиатора пул. Некоторые везикулы, находящиеся на расстоянии от АЗ, способны быстро перемещаться к сайтам экзоцитоза и впоследствии принимать активное участие в секреции медиатора (мобилизационный пул) [8]. Во многих НО (в том числе, в двигательном НО лягушки) восстановление этих двух пулов протекает посредством клатрин-зависимого быстрого эндоцитоза с плоской поверхности плазматической мембраны [9], а рециклирование таких везикул происходит по быстрому (1 мин и меньше) короткому пути. При высокочастотной стимуляции в секрецию медиатора включаются везикулы резервного пула, которые восполняются медленным эндоцитозом с участием глубоких мембранных инвагинаций и эндосомоподобных структур [1, 8]. В этом случае везикулы рецикли-руют по медленному (5-20 мин) длинному пути. Возможно, что часть везикул этой популяции во-
обще не подвергается Са2+-зависимому экзоцито-зу, составляя "покоящийся" пул [2, 6, 8].
Контроль кинетики рециклирования везикул является одним из самых сложных вопросов современной синаптологии [2, 4, 7, 8]. Обсуждается роль Са2+-зависимых реакций, малых ГТФаз, циклов фосфорилирования-дефосфорилирова-ния мембранных белков и фосфолипидов, перестройки цитоматрикса, различных протеинкиназ [6, 10, 11]. Многие белки, вовлеченные в везикулярный цикл, являются субстратами для фосфо-рилирования цАМФ-зависимой протеинкиназой А [12, 13]. Однако роль цАМФ пути в кругообороте синаптических везикул пока остается дискуссионным вопросом. Неизвестно, как влияют цАМФ-зависимые ферменты на мобилизацию везикул, принадлежащих к разным пулам, на быстрый и медленный типы эндоцитоза, на участие разных пулов везикул в освобождении медиатора?
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной и портняжной мышц лягушек (Rana Ridibunda) в осенне-зимний период. Мышцу фиксировали в стеклянной ванночке, заполненной раствором Рингера (рН 7.2-7.4; 20°С) для холоднокровных (ммоль/л): NaCl-115.0, KCl-2.5, CaCl2-1.8, NaHCO3-2.4. Применяли мембранопроникающие негидролизуемые аналоги цАМФ (100 мкМ 8-Бг-цАМФ/8-Ъгошо-cyclic AMP, 50 мкМ Б^-цАМФ/N6, 02-dibutyryl-cyclic AMP). Данные экспериментов с использованием 8-Бг-цАМФ и B^-цАМФ объединялись в одну выборку под названием "аналоги цАМФ". Для селективного ингибирования аденилатцикла-зы применяли 1мкМ MDL/ds-N-(2-Phenylcyclo-pentyl)-azacyclotridec-1-en-2-amine. Все использованные вещества фирмы SIGMA (США).
Электрофизиология. Для предотвращения сокращения мышцу рассекали. Отведение токов концевой пластинки (ТКП) для последующей компьютерной обработки проводили в условиях двухэлектродной фиксации мембранного потенциала с использованием стеклянных микроэлектродов, имеющих сопротивление 3-5 MQ и заполненных 2.5 М KCl. Двигательный нерв раздражали либо одиночными прямоугольными импульсами сверхпороговой амплитуды (1 раздражение в 4 с), либо высокочастотной ритмической пачкой импульсов (20 имп/с).
Флуоресцентная микроскопия. В экспериментах использовали флуоресцентный краситель -FM1-43 ("Biotium", США) в концентрации 2-3 мкмоль/л. Краситель обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся си-
наптических везикул ("загружается" в НО) [5, 14, 15]. Для исследования динамики эндоцитоза в процессе высокочастотной активности синапса (рис. 2, А) FM1-43 апплицировали на 1 мин при стимуляции 20 имп/с в течение 1-й мин, на 2-ю мин при двухминутной стимуляции и на 3-ю мин при трехминутной стимуляции. Для определения динамики эндоцитоза после прекращения стимуляции краситель добавляли на 1 мин в разные периоды после завершения трехминутного раздражения. В случае успешной загрузки красителя, в НО выявлялись светящиеся пятна, отражающие скопления синаптических везикул, прошедших экзо- и эндоцитоз в области АЗ (рис. 2, Б).
Чтобы выяснить динамику экзоцитоза везикул, НО предварительно загружали красителем. Для этого раздражали препарат в течение 3 мин с частотой 20 имп/с в присутствии красителя, затем препарат отмывался 30 мин в растворе Рингера. После чего препарат повторно стимулировали с частотой 20 имп/с, анализируя снижение интенсивности флуоресценции ("выгрузка" красителя). Флуоресценцию наблюдали с помощью микроскопа МИКМЕД-2 ("ЛОМО", Санкт-Петербург): объектив Olympus LUMPLFL 60xw. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах (о.е.), принимая максимальное свечение пикселя равное 256 за 1. Для характеристики свечения в сфокусированном участке НО (длиной 30-40 мкм) выделялись контуры пятен (при этом старались, чтобы площадь выделения была близкой у всех пятен НО). Далее определялась средняя величина флуоресценции внутри каждого пятна и среди всех пятен НО. Значение фонового свечения определяли как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 х 50 пикселей в участке изображения без НО, которое в дальнейшем вычитали из средней величины свечения НО. Ширину (диаметр) нервных терминалей определяли с помощью программы ImagePro, как среднее расстояние между двумя противолежащими краями мембраны НО.
Количественные результаты исследования представлены в форме - среднее значение ± стандартное отклонение, n - число независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эффекты аналогов цАМФ и ингибитора синтеза цАМФ на секрецию медиатора при редком и длительном высокочастотном раздражении. При одиночных раздражениях двигательного нерва (одно раздражение в 4 с) эффект мембранопро-никающих негидролизуемых аналогов цАМФ -8-Вг-цАМФ (100 мкМ) и В12-цАМФ (50 мкМ) проявлялся в виде достоверного увеличения амплитуды ТКП на 18.5 ± 3 % (n = 5) и 17.5 ± 3 % (n = 5), соответственно (рис. 1, А).
%
120 100 80 60 40 20
А
< я
е
<
CQ
s
Q
%
100 80 60 40 20
ПЕТРОВ и др. Б
ХТКП, нА 150000
100000 h
50000
2.0 2.5 3.0 мин
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
мин
Рис. 1. Влияние аналогов цАМФ и ингибитора аденилатциклазы на секрецию медиатора.
А - изменения амплитуды ТКП при одиночных раздражениях. По оси ординат - амплитуда ТКП через 40 мин действия исследованного агента (% от исходной). Б - динамика амплитуды ТКП в течение 3 мин раздражения с частотой 20 имп/с. По оси ординат - амплитуда ТКП (% от амплитуды первого ТКП в ритмической серии). В - кумулятивные кривые амплитуд ТКП в процессе ритмического раздражения (нА). По оси ординат - суммарная амплитуда ТКП (нА). На Б и В - по осям абсцисс отложено время раздражения (мин). Черные кружки - значения в контроле, серые квадраты и светлые треугольники - на фоне действия аналогов цАМФ и MDL, соответственно.
В контроле длительное ритмическое раздражение двигательного нерва сопровождалось характерными изменениями амплитуды ТКП (рис. 1, Б). После короткого периода облегчения наблюдалось постепенное уменьшение амплитуды ТКП. К 30 с стимуляции а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.