ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 427, № 3, с. 411-413
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 615.357:616.61-085-06
РОЛЬ ТИРОЗИНОВЫХ КИНАЗ В РЕГУЛЯЦИИ ВОДНО-СОЛЕВОГО ГОМЕОСТАЗА У АМЕБЫ AMOEBA PROTEUS © 2009 г. Я. Ю. Багров, Ä. Я. Багров, Н. Б. Манусова, Е. Р. Никитина
Представлено академиком В.Л. Свидерским 17.02.2009 г. Поступило 17.02.2009 г.
Антидиуретический гормон (АДГ) не относится формально к категории веществ, чей эффект опосредован через тирозинкиназу (ТК). Между тем есть основания предполагать возможность участия ТК в эффектах АДГ, осуществляемых через оба типа рецепторов - V1 и V2. Так, ТК участвует в каскаде внутриклеточных реакций, приводящих к активации МАР-киназы [1]. Этот фермент является необходимым компонентом системы передачи сигнала от рецепторов вазопрес-сина типа V2 на этапах, следующих за образованием цАМФ [2].
В экспериментах с использованием ингибиторов ТК эрбстатина и генистеина нами было показано, что этот фермент оказывает тормозящее действие на стимулированный аргинин-вазопрес-сином (АВП) транспорт воды через апикальную мембрану мочевого пузыря лягушки Rana temporaria [3, 4]. Роль ТК в гидроосмотическом эффекте АВП у простейших не исследована. Ранее была установлена способность АВП и его функциональных аналогов стимулировать водный транспорт через наружную мембрану A. proteus [5, 6]. Нами также было показано, что в отличие от R. temporaria у A. proteus протеинкиназа С (ПКС) может играть роль положительного регулятора эффекта АВП [7]. Факт взаимодействия ТК и ПКС в регуляции ионного транспорта был установлен на кишечном эпителии угря Anguilla anguilla, который используется как биологическая модель ионного транспорта в толстом сегменте восходящего колена петли Генле млекопитающих [8].
Целью настоящей работы было исследование роли ТК в спонтанном и стимулированном АВП и его функциональными аналогами транспорте воды через наружную мембрану амебы A. proteus.
Опыты были проведены на культуре пресноводных свободно живущих амеб A. Proteus, как
было описано нами ранее [9]. Транспорт воды оценивали по частоте сокращений сократительной вакуоли. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с использованием одно-факторного дисперсионного анализа (one-way "ANOVA") и теста Newman-Keuls (программа GraphPad Prism 3).
На рис. 1а представлены концентрационные кривые, характеризующие эффект ингибиторов ТК эрбстатина (ингибитора мембранно-связан-ной формы ТК) и генистеина (ингибирующего как мембранно-связанную, так и цитозольную форму ТК [10, 11]) на спонтанную частоту сокращения вакуоли амебы. Эрбстатин стимулировал сокращения вакуоли в концентрациях от 10.0 до 100.0 нМ, в то время как генистеин оказывал аналогичный эффект в концентрациях от 100.0 до 1000.0 нМ. В дальнейших экспериментах использовали концентрацию обоих ингибиторов, не оказывающую действие на сокращение вакуоли.
Как представлено на рис. 16, АВП и ддАВП (селективный агонист V2-рецепторов) в концентрации 1 мкМ вызывали у A. proteus гидроосмотический эффект. Генистеин в концентрации 0.1 нМ в отличие от эрбстатина подавлял эффект АВП, в то время как эффект агониста V2-рецепторов -ддАВП подавляли оба ингибитора ТК. Гидроосмотические эффекты активатора аденилатцик-лазы (АЦ) - форсколина (1 мкМ) и ингибитора V-типа фосфодиэстеразы - запринаста (1 мкМ) были подобны действию АВП и оказались чувствительными к обоим ингибиторам ТК (рис. 1в) [12]. Таким образом, складывается впечатление, что действие эрбстатина у амебы A. рroteus не ограничивается мембранно-связанной или рецеп-торной формой ТК.
Как показано на рис. 1г, цАМФ (1 мкМ) и селективный агонист аденозиновых А2-рецепторов ДПМА (ди(пропилен гликоль)метил эфирацетат) (10 нМ) вызывали сокращения сократительной вакуоли амебы A. рroteus. Генистеин и эрбстатин блокировали эффекты как цАМФ, так и ДПМА (рис. 1г). Это наблюдение хорошо согласуется с ранее полученными данными о том, что экзогенный цАМФ вызывает у амебы гидроосмотиче-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петерубрг
412
БАГРОВ и др.
(a)
Частота сокращения вакуоли, усл. ед.
40 г
30
(б)
20
10
0
-Генистеин
■ Эрбстатин
Контр-10 -9 -8
-7 -6 -5 -lgC(M)
30
20
10
## ##
30 г
20
10
(в)
##
##
##
##
30
20
10
(г)
##
##
#
0
**
**
#
#
0
0
Рис. 1. Влияние ингибиторов тирозинкиназы (ТК) на гидроосмотические эффекты аргинин-вазопрессина и его функциональных аналогов.
а - концентрационные кривые ингибиторов ТК. б - влияние АВП (1 мкМ) и ддАВП (1 мкМ) на частоту сокращений вакуоли амебы в присутствии ингибиторов ТК. в - влияние форсколина (1 мкМ) и запринаста (1 мкМ) на частоту сокращений вакуоли амебы в присутствии ингибиторов ТК. г - влияние цАМФ (1 мкМ) и ДПМА (10 нМ) на частоту сокращений вакуоли амебы в присутствии ингибиторов ТК. Сокращения: ГЕН - генистеин, ЭРБ - эрбстатин, ФОРСК -форсколин, ЗАПР - запринаст, остальные см. в тексте. * р < 0.05; ** р < 0.01 по сравнению с контролем. # - Р < 0.05; ## - Р < 0.001 по сравнению с эффектами АВП, ддАВП, форсколина, запринаста, цАМФ и ДПМА.
ский ответ, активируя рецепторы расположенные на наружной мембране и относящиеся к аде-нозиновым рецепторам типа А2 [7].
В настоящем исследовании впервые показано, что у простейших ТК принимают участие в регуляции водно-солевого гомеостаза. На основании полученных данных можно придти к следующему выводу. Система передачи сигнала от рецептора У2 до внутриклеточного цАМФ у А. ргс^еш находится под стимулирующим влиянием ТК. Об этом свидетельствует ингибирующее действие генисте-ина и эрбстатина на гидроосмотические эффекты селективного агониста У2-рецепторов ддАВП, активатора АЦ форсколина и нигибитора фосфоди-эстеразы У-типа запринаста.
Согласно нашим данным аналогичное действие ТК оказывает и на гидроосмотический эффект экзогенного цАМФ, осуществляемого через А2-рецепторы. Ранее было показано, что у амебы 6ю1уо81еНит ^со1ёеит экстрацеллюляр-ный цАМФ активирует АЦ и способствует обра-
зованию внутриклеточного цАМФ, т.е. действует аналогично вазопрессину [14]. Поскольку в настоящем исследовании наряду с эффектами ддАВП, форсколина и запринаста генистеин и эрбстатин также блокировали действие экзогенного цАМФ и селективного агониста А2-рецеп-торов ДПМА, механизм ранее описанный у D. Discoideum, может играть роль и в регуляции водного транспорта у A. proteus. Наши результаты не дают возможности определить, на каком уровне передачи сигнала от рецепторов V2 и А2 ТК оказывает модулирующее действие.
Полученные данные позволяют усомниться в том, что у простейших эрбстатин является селективным ингибитором мембранно-связанной формы ТК, поскольку этот препарат не ингибировал эффект ддАВП, но подавлял действие форсколи-на и запринаста.
Ранее нами было обнаружено, что у лягушки R. temporaria генистеин потенцировал гидроосмотический эффект АВП, ддАВП и форсколина и в
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 427 < 3 2009
РОЛЬ ТИРОЗИНОВЫХ КИНАЗ
413
то же время подавлял действие цАМФ [4]. Таким образом, все этапы передачи сигнала от рецепторов АВП до образования цАМФ у лягушки находятся под негативным контролем ТК. В опытах на лягушках мы обнаружили, что отчетливо выраженный негативный контроль со стороны ТК осуществляется при стимулировании водного потока добавлением в среду инкубации маннитола, т.е. при дегидратации. Таким образом, у лягушки ТК путем обратной связи препятствует гипергидратации клетки [4]. Подобная роль ТК была показана на изолированных клетках эпителия головного мозга и почечного эпителия млекопитающих [15]. Очевидно у одноклеточных организмов подобная функция ТК еще не сфор-мировлась.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hohmann S., Krantz M., Nordlander B. // Meth. Enzy-mol. 2007. V. 428. P. 29-45.
2. Boremeyer D, Sorocin A., Dunn V. // Ridnney Int. 1996. V. 49. № 5. P. 1187-1198.
3. Багров Я.Ю., Дмитриева НИ., Манусова Н.Б. // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 199б. Т. 82. № 4. С. 70-74.
4. Багров Я.Ю., Дмитриева НИ, Манусова Н.Б. // Нефрология. 1997. Т. 1. № 4. С. 64-68.
5. Mayers P, Couillard P. // Endocrinology. 1990. V. 80. № 1. P. 24-32.
6. Bagrov Y.Y., Manusova N.B., Nikitina E.R. // Protistology. 2003. V. 3. № 1. P. 4-6.
7. Багров Я.Ю, Манусова Н.Б. // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2005. Т. 41. № 6. С. 562-565.
8. Hoffmann E.K., Schettino T., Marshall W.S. // Comp. Biochem. and Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 2007. V. 148. № 1. P. 29-43.
9. Багров Я.Ю, Манусова Н.Б., Никитина E.P. // ДАН. 2002. Т. 386. № 4. С. 559-561.
10. Linassier C, Pierre M., Le Pecq J.B., Pierre J. // Biochem. Pharmacol. 1990. V. 39. № 1. P. 187-193.
11. Umezawa K, Hori T., Tajima H. et al. // FEBS Lett. 1990. V. 260. № 2. P. 198-200.
12. Багров Я.Ю, Манусова Н.Б. // ДАН. 2007. Т. 414. № 2. С. 130-132.
13. Lepple-Wienhues A., Szabo I, Wieland U. et al. // Cell. Physiol. Biochem. 2000. V. 10. № 5/6. P. 307-312.
14. Van Haastert P.J. // Biochem. J. 1994. V. 303. № 2. P. 539-545.
15. Pasantes-Morales H, Cardin V., Tuz K. // Neurochem. Res. 2000. V. 9/10. P. 1301-1314.
ДOKЛAДЫ AKAДEMИИ HAyK том 427 < 3 2009
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.