БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 372-379
УДК 557.175.6
РОЛЬ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ЭФФЕКТОВ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА ЧЕЛОВЕКА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ
© 2013 г. С А. Заморина*, С. В. Ширшев
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13;
*электронная почта: mantissa7@mail.ru Поступила в редакцию 30.04.2013 г.
Показано, что хорионический гонадотропин (ХГ) человека связывается с То11-подобными белками типа 4 (ТЬЮ4) на поверхности моноцитов. Методом проточной цитометрии установлено, что в присутствии высоких концентраций ХГ (100, 1000 МЕ/мл) снижается уровень СВ14+ТЬЮ4+-позитив-ных клеток в гейте моноцитов на 1, 5 и 10 мин эксперимента. Роль молекул ТЬЮ4 в реализации эффектов ХГ на функциональную активность моноцитов изучали при помощи ингибиторного анализа. ТЬЮ4-зависимую трансдукцию сигнала блокировали с помощью моноклональных антител к ТЬЮ4 и/или резвератрола, ингибирующего передачу сигнала внутриклеточными белками ТЮР/ТЮАРб на 1ЮР3 и МР-кВ соответственно. Помимо этого, подавляли активность протеинки-назы А (РКА), вовлеченной в передачу сигнала с рецептора лютеинизирующего гормона (ЛГ). Установлено, что репрессия фагоцитарной активности моноцитов, обусловленная ХГ, зависела от ТЬЮ4, в то время как влияние ХГ на секрецию миелопероксидазы (МРОех) и спонтанную окислительную активность моноцитов зависело от РКА. Эффекты гормона на стимулированную окислительную активность моноцитов и продукцию ими интерлейкинов (1Ь) 1 и 8 зависели как от доступности ТЬЮ4, так и от активности РКА. Таким образом, выявлен новый механизм взаимодействия гормона с моноцитами, опосредованный молекулами ТЬЮ4, которые служат неканоническими рецепторами гормона.
Ключевые слова: хорионический гонадотропин, То11-подобные рецепторы 4 типа, ЛГ-рецептор, моноциты.
DOI: 10.7868/S0233475513050241
Хорионический гонадотропин (ХГ) — это гли-копротеидный гормон, трофобластный аналог лютеинизирующего гормона (ЛГ). ХГ активно контролирует иммунные процессы, сопровождающие беременность, реализуя свои эффекты через ЛГ-рецептор, что обусловлено высокой гомологией с ЛГ [1]. Известно, что ХГ регулирует фагоцитарную, окислительную и секреторную активность моноцитов у женщин [2]. Известно, что в моноцитах небеременных женщин, используемых в модели in vitro, ЛГ-рецептор экспресси-руется на очень низком уровне [3]. Таким образом, очевидно, что существует "неканонический" рецепторный аппарат для ХГ. Ранее мы предположили, что в реализацию эффектов ХГ на уровне моноцитов вовлечены Toll-подобные белки (TLR4), относящиеся к паттерн-распознающим рецепторам (ПРР) [4, 5]. В основе этого взаимодействия лежит структурное сходство внеклеточных доменов рецепторов ЛГ и TLR4, обусловленное высоким содержанием остатков лейцина (так называемые leucin-rich repeats (LRR)) [6].
Молекулы ТЬЯ4 в комплексе с СЭ14 распознают липополисахариды (ЛПС), запуская синтез провоспалительных цитокинов через МБ-кВ-за-висимый механизм. В настоящее время существует концепция о способности этих рецепторов индуцировать асептическое воспаление через распознавание продуктов деградации клеток и внеклеточного матрикса [7]. К эндогенным ли-гандам ПРР относят несколько десятков молекул: белки теплового шока, модифицированные ли-попротеины низкой плотности, компоненты внеклеточного матрикса (гиалурон, бигликан, экстрадомен А фибронектина, белок А сурфактанта, гепарансульфат), фибриноген, фрагменты ДНК и мРНК, р-дефензин и т.д. [8, 9]. ХГ, по-видимому, также является эндогенным лигандом ТЬЯ4, выступая в качестве конформационного антагониста ЛПС. В частности, известно, что введение р-субъединицы ХГ в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [10].
Таким образом, в представленной работе изучена роль молекул TLR4 в реализации эффектов ХГ на функциональную активность моноцитов периферической крови женщин. Оценивали фагоцитарную и окислительную активность моноцитов, а также продукцию провоспалительных цитокинов — интерлейкинов (IL)-1ß и IL-8.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали фракционированные моноциты небеременных женщин репродуктивного возраста, находящихся в ранней фолликулярной фазе менструального цикла. Мононуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/см3). Полученную суспензию после двойной отмывки средой 199 помещали на чашки Петри с 5% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (ЭТС) и инкубировали в течение 45 мин при 37°С, затем прикрепившиеся моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали и стабилизировали инкубированием в течение 45 мин при 4°С [11]. Чистота выделения моноцитов, оцениваемая иммунофлуоресцентным методом с использованием моноклональных антител к CD14 (Primary Anti-Human CD14; ICN Ph., США), составляла 85%.
Влияние ХГ на функциональную активность моноцитов изучали с использованием гормона (Profasi, Италия) в концентрации 100 ME/мл, что соответствует его пику на 9—11 нед беременности [12]. Связывание гормона с TLR4 изучали с использованием сверхвысокой дозы ХГ 1000 МЕ/мл. Поверхностную экспрессию CD14 и TLR4 оценивали на проточном цитофлуориметре BD Calibur (США) после 1-, 5-, 10- и 15-мин инкубации клеток с ХГ (100, 1000 МЕ/мл) с использованием моноклональных антител (TLR4(CD284)/PE и CD14/FITC, eBioscience, Канада) и соответствующих изотипических антител в качестве контроля. Данные опытов по связыванию ХГ с TLR4 (n = 4) оценивали с помощью ^-критерия Ман-на—Уитни.
Моноциты (1 х 106 мл) инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ Z-глутамина, 100 мкг/мл гентами-цина и 10% ЭТС) с гормоном в течение 1 ч при 37°С для оценки фагоцитарной активности и 48 ч для оценки продукции цитокинов при 37°С в присутствии 5% СО2. Для блокады Toll-зависимо-го пути применяли антитела к TLR4 (abTLR4; eBioscience, Канада; clone HTA125, 0.5 мг/мл), которые вносили в культуру до ХГ (5 мин, 37° С), при этом ряд проб содержал изотипические антитела в качестве контроля (данные не приведены). Для внутриклеточной блокады сигнала с TLR4 применяли резвератрол ((Res), Sigma, США, 50 мкмоль/мл), который вносили в культуру мо-
ноцитов за 1 ч до ХГ. Res блокирует как комплекс TRIF, участвующий в передаче сигнала на IRF3 [13], так и TRAF6, вовлеченный в передачу сигнала на NF-kB [14] (рис. 2). Учитывая, что взаимодействие ХГ с ЛГ-рецептором приводит к повышению внутриклеточного уровня сАМР, активирующего протеинкиназу А (РКА), в ряде проб применяли блокатор РКА Н-89 (ICN Ph, США) в концентрации 10 мкмоль/мл [15] (рис. 2).
Фагоцитарную активность моноцитов оценивали по поглощению бактерий генно-инженерного штамма Escherichia coli lux+. Метод разработан и запатентован в Лаборатории иммунорегуля-ции ФГБУН УрО РАН, г. Пермь [16]. Клетки E. coli lux+ обладают способностью к биолюминесценции, которая значительно снижается в процессе поглощения моноцитами. Готовую суспензию бактерий (180 мкл, 5 х 106 /мл) вносили в лунки 96-луночного планшета для люминоскана (Microlitetm1, Финляндия), инкубировали при 37°С в течение 3—5 мин и оценивали фоновый уровень свечения бактерий. После внесения клеточной культуры (соотношение клетки/бактерии = = 1/10, в среду добавлено 10% аутоплазмы для оп-сонизации), измеряли степень гашения биолюминесценции на 20-й мин эксперимента. Индекс фагоцитарной активности клеток (ИФА), отражающий снижение биолюминесценции (%) по сравнению с исходным уровнем, рассчитывали по формуле: ИФА = ((X1 - X2)/X1) х 100, где Х1 -интенсивность биолюминесценции контрольной пробы, Х2 - интенсивность биолюминесценции опытной пробы. Измерение производили на лю-минометре Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Финляндия).
Окислительную активность моноцитов оценивали по продукции активных форм кислорода (АФК) в реакции люминол-зависимой хемилю-минесценции (ЛЗХЛ) [17]. Для этого в лунку плоскодонного планшета вносили 180 мкл раствора, содержащего 110 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, 2.5 MgCl2, 5 мМ глюкозы и 10-4 М люминола (pH 7.4). После инкубации среды для хемилюми-несценции в течение 3-5 мин при 37°С и замера фонового свечения добавляли 20 мкл клеточной суспензии (5 х 106/мл), и измеряли интенсивность спонтанной хемилюминесценции. Затем в кювету вносили 20 мкл опсонизированных клеток E. coli К-12 и измеряли интенсивность стимулированной хемилюминесценции на 20-й мин эксперимента. Измерения проводили на люми-нометре Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Финляндия).
Активность MPOex в супернатантах культур моноцитов тестировали спектрофотометрически [18]. Для этого 50 мкл клеточного супернатанта помещали в лунки плоскодонных 96-луночных планшетов для иммунных реакций, затем вносили
TLR4
104
103 102 101
ш 38.3%
......... 1 ' Контроль ....... ......... .........
ЗАМОРИНА, ШИРШЕВ а
104 103
101
100
= Шй^ ■ ■ - 24.7%
- ХГ 1С - 1 ми ......... ' | »00 МЕ/мл н ....... ......... .........
104
103
102
101
100
19.4%
.■ . - ' . - ХГ 100 =" 5 мин ......... ' ' ' 0 МЕ/мл ...... ......... .........
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
FL1-H
FL1-H
FL1-H
CD14
80
*60
+
^ 40
+
4
3 20
U 20
0
Контроль 1 мин 5 мин 10 мин 15 мин — — ХГ 100 МЕ/мл ■ ХГ 1000 МЕ/мл
Рис. 1. Влияние ХГ на детекцию CD14+TLR4+-KreTOK в системе in vitro. а — Гистограммы, отражающие влияние ХГ на количество CD14+TLR4+-клеток в культуре (данные одного эксперимента). В правом верхнем квадранте указан процент двойных позитивных клеток в гейте моноцитов (гейтировано по FSS/SS). По оси абсцисс — интенсивность флуоресценции по каналу FL1, FITC; по оси ординат — по каналу FL2, PE. б — Влияние ХГ на детекцию CD14+TLR4+-клеток в динамике (n = 4); ^Статистически значимые (Р < 0.05) по ^-критерию Манна—Уитни отличия от контроля.
100 мкл субстратной смеси, состоящей из 0.04% ортофенилендиамина и 0.014% Н2О2 на фосфат-цитратном буфере (рН 5.0). После 10-мин инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали, добавляя 100
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.