ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 5, с. 687-694
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
РОЛЬ УГЛЕВОДОВ В РЕАКЦИИ ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ НА КРАТКОВРЕМЕННЫЕ И ДЛИТЕЛЬНЫЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ © 2010 г. Е. Ф. Марковская*, Е. Г. Шерудило*, Н. А. Галибина**, М. И. Сысоева*
*Учреждение Российской академии наук Институт биологии Карельского научного центра РАН, Петрозаводск **Учреждение Российской академии наук Институт леса Карельского научного центра РАН, Петрозаводск
Поступила в редакцию 22.04.2009 г.
Изучали динамику содержания компонентов водорастворимой фракции углеводов и холодоустойчивость семядольных листьев растений огурца (Cucumis sativus L.), подвергнутых на ранних этапах онтогенеза кратковременному (2 ч в конце ночного периода — ДРОП) или длительному (постоянному в течение суток — ПНТ) 6-суточному воздействию пониженной до 12°С температуры. Растения огурца варианта ПНТ характеризовались аккумуляцией олигосахаридов, а варианта ДРОП — повышенным содержанием глюкозы, фруктозы и раффинозы, что свидетельствует о более высоком их метаболическом статусе. При сравнении динамики устойчивости с изменениями углеводных фракций выявлена синхронизация этих изменений для варианта ПНТ и асинхронизация части фракций глюкозы и олигосахаридов — для растений варианта ДРОП. Предполагается, что в семядольных листьях огурца варианта ДРОП формируется два пула сахаров, один из которых участвует в формировании устойчивости, а другой — в активном метаболизме. Это обеспечивает сочетание повышенного уровня жизнедеятельности и высокого уровня холодоустойчивости у растений этого варианта. В семядольных листьях растений варианта ПНТ все компоненты водорастворимой фракции углеводов участвуют в формировании холодоустойчивости.
Ключевые слова: Cucumis sativus — кратковременное и длительное воздействие — низкая закаливающая температура — холодоустойчивость — растворимые сахара
ВВЕДЕНИЕ
Адаптация растений к переменным суточным температурам давно привлекает внимание исследователей [1, 2]. Это касается растений, произрастающих как в природе, так и в условиях защищенного грунта. В частности, в одной из современных технологий защищенного грунта (ДРОП-технология) для выращивания компактных растений используется ежесуточное кратковременное снижение температуры до закаливающего значения [3]. В наших предыдущих работах [4, 5] показано, что такое воздействие сопровождается повышением холодоустойчивости растений, отличающейся по своей природе от устойчивости, формируемой в ходе длительной (многосуточной) низкотемпературной экспозиции. Вопрос о механизмах устойчивости при длительном воздействии низкой закаливающей температуры активно изучается [6—11]. В частности, известно, что в этом случае в формировании холодоустой-
Сокращения: ДРОП — кратковременное снижение температуры (от англ. drop), ПНТ — постоянная низкая температура. Адрес для корреспонденции: Сысоева Марина Ивановна. 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11. Институт биологии КарНЦ РАН. Факс: 007 (8142) 76-98-10; электронная почта: sy-soeva@krc.karelia.ru
чивости участвуют углеводы [10, 11]. В то же время, экспериментальные данные о формировании устойчивости в ответ на кратковременное ежесуточное действие низких температур единичны и достаточно противоречивы: отмечается как увеличение устойчивости [12], так и отсутствие ее заметного прироста [13]. Механизмы повышения устойчивости растений при этом типе воздействия до настоящего времени не выявлены, в том числе не изучена роль углеводов.
Цель настоящей работы: изучить содержание компонентов водорастворимой фракции углеводов семядольных листьев теплолюбивого растения огурца при кратковременном и длительном многосуточном действии низкой закаливающей температуры.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Семена огурца (Cucumis sativus L., сорт Зозуля) проращивали сутки в термостате при 28°С, высаживали в вазоны с песком (полив питательным раствором Кнопа с добавлением микроэлементов, рН 6.2—6.4) и помещали в камеры искусственного климата с относительной влажностью воздуха 60—70%, интенсивностью света 100 Вт/м2
(освещение лампами ДРЛ-400) и 12-часовом фотопериоде. До начала эксперимента растения выращивали в оптимальных условиях: 2 суток при 30°С до выноса семядолей и 2 суток при 23°С до полного раскрытия семядолей. По достижении фазы полностью раскрытых семядолей растения подвергали в течение 6 суток низкотемпературным обработкам: выращивали при постоянной суточной температуре 12°С (вариант постоянной низкой температуры — ПНТ) или снижали температуру до 12°С на 2 ч в конце ночи путем перестановки растений в другую камеру (вариант ежесуточных кратковременных снижений температуры — ДРОП). Растения контрольного варианта выращивали при температуре 20°С на протяжении всего эксперимента. К концу опыта (на 11-е сутки) растения в контроле и варианте ДРОП находились в фазе полностью развернутого 1-го настоящего листа, в варианте ПНТ имели зачаточный 1-й лист. Работа выполнена на семядольных листьях огурца. Образцы растений брали для анализа ежесуточно в дневное время следующих за низкотемпературной обработкой суток. Ежедневно контролировали холодоустойчивость растений, вычисляя ЛТ50, т.е. температуру гибели 50% полисадных клеток листовых высечек после их 5-минутного промораживания в микрохолодильнике [14].
При анализе углеводов растительный материал фиксировали жидким азотом с последующим лиофильным высушиванием. Экстракцию углеводов проводили по методике [15]. Сухую навеску измельчали, помещали в фарфоровую чашку и экстрагировали дважды 80% этиловым спиртом при 50°С в течение 30 мин. Спиртовые экстракты объединяли и упаривали на водяной бане при 35—40°С. Полученный сухой остаток, содержащий моно-, ди- и олигосахариды, растворяли в 3—5 мл (в зависимости от предполагаемого количества углеводов) бидистиллированной воды и фильтровали через бумажные фильтры. Фильтрат подвергали тщательной очистке методом твердофазной экстракции [15] для освобождения от мешающих компонентов, таких как пигменты, полисахариды, различные соли и органические кислоты. Для этого растворы образцов пропускали через мембранные фильтры с диаметром пор 0.2 мкм, а потом через патроны Диапак—Амин. После очистки на патроне моно-, ди-, олигосахара, полученные из растительных образцов, анализировали на ВЭЖХ системы Стайер ("Аквилон", Россия). Пробу разделяли на колонке Яе2ех ЯСМ-Мопо8ассИаг1ёе ("РИепошепех", США). Размер колонки 300 х 7.8 мм. Ввод пробы осуществлялся аналитическим ручным инжектором. Объем вводимой пробы 20 мкл. Температуру 80°С поддерживали по всему объему колонки посредством термостата. Подача растворителя осуществлялась прецизионным насосом высокого давления со скоростью потока 0.6 мл/мин, в качестве элюента
использовали бидистиллированную воду. После разделения на колонке проба поступала в соединенный с хроматографом детектор рефрактометр (модель 102М, "Аквилон"). Регистрацию и обработку хроматограмм проводили с помощью программного продукта МультиХром (система сбора и обработки хроматографических данных) версии 1.52х. Критерием идентификации пиков служило время удерживания стандартных веществ. Полное время анализа одного образца — 15 мин. Для определения содержания олигосахаридов ряда раффинозы (стахиозы, вербаскозы) применяли метод внутреннего стандарта. Изучение качественного состава свободных моно- и олигосаха-ридов показало, что постоянно в семядолях огурца содержатся моносахариды (фруктоза, глюкоза), дисахарид сахароза и олигосахарид раффиноза. Также обнаружены олигосахариды семейства раффинозы: стахиоза, вербаскоза, образующиеся путем присоединения галактозы к "сахарозной затравке". В разделе РЕЗУЛЬТАТЫ представлено их суммарное количество.
Всего проведено два независимых опыта, в которых получены одинаковые закономерности. В статье представлены данные одного опыта, проведенного в 6-кратной (определение холодоустойчивости) и 3-кратной (анализ углеводов) биологических повторностях при 2-кратной аналитической повторности.
Данные обработаны статистически с использованием пакета программ Statgraphics for Windows 7.0. В связи с тем, что различные процессы (холодоустойчивость, фракционный состав углеводов) изучены в динамике и, как мы предполагаем, могут иметь однонаправленный или разнонаправленный характер изменения, для анализа их сходства был применен метод многомерных временных рядов [16]. Были рассчитаны значения взаимно корреляционной функции (коэффициенты кросс-корреляции), позволяющие оценить степень взаимосвязей различных исследуемых процессов между вариантами опытов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Биологической особенностью огурца является наличие семядольных листьев, которые как запасающие и фотосинтезирующие органы вносят большой вклад в адаптацию растения на ранних этапах онтогенеза. В настоящей работе перед началом опыта углеводный статус семядольных листьев огурца определялся наличием еще не израсходованной запасной формы углеводов (по-видимому, крахмала), продуктов их гидролиза (моно-, ди- и олигосахара) и наличием вновь синтезированных фотоассимилятов [17]. Учитывая, что запасные вещества семядолей огурца расходуются за 7—10 дней [18], можно считать, что на протяжении всего опыта перечисленные компоненты уг-
леводного состава сохранялись, изменялось лишь их количественное соотношение.
Изучение качественного состава свободных моно- и олигосахаридов показало, что моносахариды (фруктоза, глюкоза), дисахарид (сахароза) и олигосахариды ряда раффинозы (раффиноза, стахиоза, вербаскоза) присутствовали в семядолях огурца на протяжении эксперимента во всех вариантах опыта.
Вариант контроль. К началу опыта проростки огурца имели пул растворимых сахаров, основную фракцию которых составляли олигосахариды. Детальный анализ углеводного статуса семядолей огурца показал, что фракция олигосахари-дов практически не менялась в первые двое суток (рис. 1). Однако, начиная с третьих суток, их концентрация снижалась и к концу эксперимента составляла половину от первоначального уровня. В первые сутки в контроле выявлено более чем десятикратное увеличение концентрации раффинозы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.