ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 464, № 4, с. 508-511
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 557.27:616.48/.45
РОЛЬ В-ЛИМФОЦИТОВ В ПРЕЗЕНТАЦИИ АУТОАНТИГЕНОВ CD4+-Т-ЛИМФОЦИТАМ ПРИ АУТОИММУННОМ ТИРЕОИДИТЕ © 2015 г. Е. М. Куклина, Е. Н. Смирнова, И. В. Некрасова, Т. С. Балашова
Представлено академиком РАН В.А. Черешневым 06.04.2015 г. Поступило 16.04.2015 г.
Изучали экспрессию молекул, участвующих в презентации антигена В-лимфоцитами, у больных аутоиммунным тиреоидитом (АИТ), а также непосредственную антигенпрезентирующую активность В-клеток при данной патологии. Показано, что АИТ ассоциирован с повышенной экспрессией костимулирующей молекулы CD80 наивными В-лимфоцитами (CD19+CD27-клетки) как ex vivo, так и в ответ на поликлональную активацию клеток в культуре. В эксперименте in vitro выявили способность В-лимфоцитов, нагруженных антигеном, индуцировать пролиферацию аутологичных cd^-k^tok, в том числе у пациентов с АИТ — аутоспецифичных Т-клеток. Учитывая интенсивную инфильтрацию В-лимфоцитами тиреоидной ткани при АИТ, обнаруженная в работе потенциальная антигенпрезентирующая активность В-лимфоцитов, по-видимому, вносит вклад в развитие данной патологии.
DOI: 10.7868/S0869565215280270
Аутоиммунный тиреоидит (АИТ) — аутоиммунное заболевание, которое связано с поражением тиреоидных клеток и в зависимости от типа аутоантигена может сопровождаться развитием первичного гипотиреоза (в случае, если аутоанти-геном служат, например, тиреоидная пероксидаза (ТПО), тиреоглобулин (ТГ) и другие компоненты тиреоидной ткани) или гипертиреоза, если, например, в качестве аутоантигена выступает рецептор для тиреотропного гормона. Важная роль В-клеточного звена иммунитета в развитии данной патологии убедительно показана еще в работах 2000-х годов. Так, у мышей с генетически обусловленным дефицитом В-лимфоцитов и у животных, у которых В-клеточная популяция истощена введением соответствующих антител, не развивается в отличие от интактных животных спонтанный аутоиммунный тиреоидит [1]. Кроме того, В-лимфоциты практически всегда присутствуют в составе иммунных клеток, инфильтрирующих щитовидную железу при аутоиммунных тиреоидитах, причем они формируют в тиреоид-ной ткани зародышевые центры, аналогичные таковым во вторичных лимфоидных органах. Для АИТ, ассоциированных с первичным гипотирео-
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь E-mail: ibis_07@mail.ru
Пермский государственный медицинский университет им. Е.А. Вагнера Минздрава России
зом, эти образования выявляются в 70—100% случаев [2—4]. При этом установлено, что подавление аутоиммунных процессов в ответ на истощение В-клеточной популяции не связано с продукцией аутоантител, так как их введение не приводит к развитию патологии [1]. А на других моделях спонтанных аутоиммунных патологий у животных, таких как диабет аутоиммунной природы или волчаночный синдром, убедительно показано, что основная роль В-лимфоцитов в их развитии — антигенпрезентирующая [5, 6]. Все сказанное выше указывает на необходимость исследования роли В-лимфоцитов в развитии АИТ. В первую очередь — изучения В-клеточных функций, не связанных с продукцией антител. В доступной литературе мы не обнаружили данных по этой проблеме.
Целью настоящей работы была оценка анти-генпрезентирующей способности В-лимфоцитов у пациентов с АИТ.
В работе исследовали лейкоциты больных с верифицированным диагнозом "Аутоиммунный тиреоидит". Больные не получали иммуномодулиру-ющую терапию в течение 30 дней до взятия образцов крови. Диагноз ставился согласно клинической классификации болезней 2002 г.: наличие первичного гипотиреоза (ТТГ > 4 мЕд/л), антител к ТПО и сонографических признаков заболевания. Средний возраст пациентов — 30.6 ± 1.59 лет, женщин в группе — 80%. Контрольную группу составляли здоровые доноры — эутиреоидные лица с отсутствием в анамнезе заболеваний щитовидной железы, в
РОЛЬ В-ЛИМФОЦИТОВ В ПРЕЗЕНТАЦИИ АУТОАНТИГЕНОВ
509
крови которых отсутствовали антитела против ТПО. Контрольная группа была сопоставима с группой больных по возрасту (средний возраст — 33.6 ± 1.77 лет) и половому составу (83% — женщины). Мононуклеарные клетки выделяли из ге-паринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-веро-графина (d = 1.077 г/см3). Полученную суспензию мононуклеарных клеток фракционировали далее на иммуномагнитных бусах для получения CD19+-B- и CD4+-Т-лимфоцитов с помощью соответствующих систем для выделения ("Invitrogen", США). CD19+-В-клетки культивировали 48 ч без митогена (спонтанный вариант) или в условиях поликлональной активации (анти-IgM/IgG + + CD40L, "Jackson ImmunoResearch Laboratories", США), которая имитирует распознавание когнатного антигена, сопровождаемое костиму-ляцией со стороны Т-лимфоцитов [7].
Потенциальную способность B-клеток пре-зентировать антигены оценивали по экспрессии костимулирующих молекул, необходимых для адекватного ответа Т-лимфоцита на презентируе-мый антиген, — CD80, CD86 и молекулы HLA-DR, в составе которой В-лимфоциты представляют антиген CD4+-Т-клеткам. Эти показатели оценивали с помощью проточной цитометрии в условиях ex vivo (в суспензии мононуклеарных клеток) и in vitro (в культуре фракционированных CD19+-клеток) отдельно в наивных В-лим-фоцитах (CD19+CD27-) и В-клетках памяти (CD19+CD27+). Во всех пробах определяли процент клеток, несущих конкретный маркёр, и уровень экспрессии данного маркёра, идентифицируемый как средняя интенсивность свечения клеток (Mean Fluorescence Intensity, MFI).
Для непосредственной оценки антигенпрезен-тирующей активности B-лимфоцитов пациентов с АИТ определяли способность B-клеток вызывать активацию CD4+-Т-лимфоцигов, реактивных в отношении основных аутоантигенов, ассоциированных с данной аутоиммунной патологией — ТПО, ТГ, а также в отношении экзогенного антигена — столбнячного токсина (СТ, положительный контроль). Для этого фракционированные В-лимфоциты (CD19+-клетки, 1 х 106 клеток/мл) преинкубировали с антигенами — рекомбинантной ТПО (10 мкг/мл), нативным человеческим ТГ (10 мкг/мл) или экзогенным СТ (5 мкг/мл) в течение 12 ч. После чего клетки отмывали от антигенов. Аутологичные фракционированные CD4+-^лимфоциты (1 х х 107 клеток/мл) предварительно окрашивали 10 мкМ сукцинимидным эфиром карбоксифлуо-ресцеиндиацетата (Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester, CFSE) в течение 5 мин в забуфе-ренном фосфатами физиологическом растворе, после чего также отмывали от несвязавшегося красителя. Нагруженные антигеном В-лимфоци-
ты и аутологичные CFSE-меченые Т-клетки далее культивировали совместно в течение 5 сут. По окончании культивирования оценивали про-лиферативную активность CD4+-Т-лимфоцитов с помощью проточной цитометрии [8]. Статистический анализ проводили с использованием критерия t Стьюдента.
Установлено, что доля наивных В-лимфоцитов и В-клеток памяти, а также их соотношение в периферической крови у пациентов с АИТ достоверно не отличались от соответствующих показателей здоровых доноров (отношение CD19+CD27-/CD19+CD27+-клеток было равно 2.68 ± 0.253 для здоровых доноров, 2.44 ± 0.301 — для больных АИТ, p > 0,05). Экспрессия костимулирующих молекул CD80 и CD86 в обеих исследуемых группах была статистически значимо выше в популяции В-клеток памяти по сравнению с наивными В-лимфоцитами ex vivo, причем повышен был как процент клеток, несущих данные маркёры, так и уровень экспрессии этих маркёров (табл. 1). Сравнение показателей экспрессии костимулирующих молекул между группами выявило повышение у пациентов с АИТ доли CD80-пози-тивных клеток в субпопуляции наивных В-лим-фоцитов (CD19+CD27--клеток), но не В-клеток памяти, а также уровня экспрессии CD80 на данных клетках (табл. 1). Экспрессия В-лимфоцита-ми CD86 хотя и демонстрировала тенденцию к повышению, статистически значимо не отличалась от соответствующих показателей здоровых доноров (табл. 1). Молекула HLA-DR конститутивно присутствовала на В-лимфоцитах, что согласуется с имеющимися в литературе данными, однако, в отличие от костимулирующих молекул, уровень ее экспрессии В-клетками памяти в обеих исследуемых группах был ниже, чем у наивных В-лимфоцитов (табл. 1). При этом для больных АИТ статистически значимых отклонений ни в количестве H LA-DR-позитивных клеток, ни в уровне экспрессии данной молекулы не выявлено (табл. 1).
Культивирование фракционированных В-лим-фоцитов (CD19+-клеток) в отсутствие активатора (спонтанный вариант) не вызывало статистически значимых изменений в экспрессии CD80 наивными В-лимфоцитами и В-клетками памяти как у здоровых доноров, так и у больных АИТ, но приводило к повышению экспрессии данного маркёра в условиях поликлональной активации клеток в обеих исследуемых группах (табл. 2). Сравнение показателей между группами не выявило статистически значимых различий в спонтанном варианте, но показало повышение экспрессии CD80 при АИТ в случае поликлональной активации. Это было справедливо и при оценке показателя процент В-лимфоцитов, несущих данный маркёр (табл. 2).
510 КУКЛИНА и др.
Таблица 1. Экспрессия костимулирующих молекул и HLA-DR В-лимфоцитами больных АИТ ex vivo (M ± m)
Группы доноров
Маркёры Здоровые доноры Больные АИТ
Процент клеток MFI Процент клеток MFI
CD80 В субпопуляции 0.219 ± 0.054 57.7 i 8.20 1.01 ± 0.259* 101 i 23.8*
ОТ19+ОТ27--клеток n = 12 n = 12 n = 10 n = 10
В субпопуляции 67.6 ± 7.30a 169 i 32.5а 62.8 ± 7.19a 203 i 70.3
ОТ19+ОТ27+-клеток n = 12 n = 12 n = 10 n = 10
CD86 В субпопуляции 0.20 ± 0.047 64.6 i 15.6 0.355 ± 0.078 89.1 i 28.3
ОТ19+ОТ27--клеток n = 12 n = 12 n = 10 n = 10
В субпопуляции 35.7 ± 4.97a 171 i 26.2а 46.6 ± 6.24a 219 i 74.9а
ОТ19+ОТ27+-клеток n = 12 n = 12 n = 10 n = 10
HLA-DR В субпопуляции 96.0 ± 1.56 368 i 60.2 96.8 ± 1.52 697 i 199
ОТ19+ОТ27--клеток n = 11 n = 11 n = 10 n = 10
В субпопуляции 98.7 ± 0.718 214 i 44.6а 98.8 ± 0.278 352 i 99.7а
ОТ19+ОТ27+-клеток n = 11 n = 11 n = 10 n = 10
Примечание. Здесь и в табл. 2 * — p < 0.05 по сравнению с показателями здоровых лиц, а — p < 0.05 по сравнению с показателем д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.