научная статья по теме РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ В ИЗМЕНЕНИЯХ МИКРОРЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ Биология

Текст научной статьи на тему «РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ В ИЗМЕНЕНИЯХ МИКРОРЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ»

УДК 612.1;591.11;577.353

РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ В ИЗМЕНЕНИЯХ МИКРОРЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ © 2014 г. А. В. Муравьев*, С. Г. Михайлова, И. А. Тихомирова

Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского, 150000, Ярославль, Республиканская ул., 108; *электронная почта: alexei.47@mail.ru Поступила в редакцию 26.02 2014 г.

Деформируемость эритроцитов (ДЭ) и, следовательно, эффективность доставки кислорода в тканевые микрорайоны, определяется тремя основными факторами: 1) эластичностью мембраны, 2) вязкостью внутреннего содержимого эритроцитов и 3) соотношением площади поверхности клетки и ее объема. При этом наибольший вклад в деформируемость клетки в целом вносит эластичность и стабильность плазматической мембраны. Имеются экспериментальные доказательства регуляции деформируемости эритроцитов с участием внутриклеточных сигнальных путей. Целью настоящего исследования было изучение роли регуляторных систем "аденилатциклаза—сАМР" и внутриклеточного кальциевого сигнального механизма в изменениях ДЭ. Получены данные о повышении ДЭ под влиянием стимулятора аденилатциклазы (АЦ) форсколина и при воздействии проникающего аналога сАМР (ёЪ-сАМР). Другой линией доказательств участия сАМР в регуляции ДЭ был положительный эффект ингибирования активности фосфодиэстераз (ФДЭ) изобутилметилксантином (ИБМК) и селективными ингибиторами винпоцетином (ФДЭ-1), цилостазолом (ФДЭ-3). Блокирование входа Са2+ в эритроциты увеличивало ДЭ на 32%. С другой стороны, стимулирование входа Са2+ в клетки кальциевым ионофором (А23187) и фторидом натрия, а также при действии ванадата натрия сопровождалось снижением ДЭ. Механическое напряжение мембраны при отсутствии Са2+ в среде не изменяло ДЭ, тогда как сочетание механического стресса с добавлением Са2+ (50—200 мкМ) в среду инкубации снижало ДЭ на 14—18%. Полученные данные позволяют предположить, что для повышения деформируемости эритроцитов нужна активация аденилатциклазной системы, тогда как для снижения деформируемости (пластичности) и, следовательно, для повышения стабильности мембраны и клетки в целом, вероятно, требуется стимулирование кальциевого сигнального каскада. Можно полагать, что координация работы этих двух молекулярных сигнальных систем осуществляется на уровне фосфодиэстераз.

Ключевые слова: мембрана эритроцитов, деформируемость, сигнальные пути, аденилатциклаза, сАМР, фосфодиэстеразы, Са2+.

Б01: 10.7868/80233475514040069

ВВЕДЕНИЕ

Одной из важных микрореологических характеристик эритроцитов является их способность к обратимой деформации. Она существенным образом влияет на выживание клеток, эффективность кровотока и оксигенацию тканей [1]. В последнее время накоплены экспериментальные доказательства регуляции деформируемости эритроцитов путем активации молекулярных сигнальных механизмов клетки [2—5]. Эта регуляция нацелена на изменение ассоциации между белками подмем-бранного цитоскелета эритроцита и интегральными белками мембраны, такими как белок полосы 3 и гликофорины [3, 6, 7]. Вероятно, для решения этой задачи зрелые эритроциты сохранили

большое число молекулярных компонентов сигнальных путей, расположенных главным образом в плазматической мембране [8—10]. Например, известно, что деформируемость эритроцитов снижается в ответ на рост концентрации Са2+ внутри клетки [1, 5]. Увеличение содержания сАМР в эритроцитах, напротив, сопровождается повышением их пластичности [11, 12]. Однако точные молекулярные механизмы регуляции деформируемости эритроцитов остаются недостаточно изученными. Это особенно касается взаимодействия двух внутриклеточных сигнальных систем — аденилатциклазной и кальциевой.

Целью настоящего исследования было изучение элементов регуляторной системы "аденилатциклаза — сАМР" и внутриклеточного кальциевого

сигнального механизма при изменении пластичности мембран эритроцитов и деформируемости клетки в целом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Кровь (15 мл) для исследования микрореологических свойств эритроцитов и молекулярных механизмов их изменений получали венопункци-ей у здоровых лиц (n = 30), в условиях клинической лаборатории. Все испытуемые дали добровольное информированное согласие на взятие крови; исследование было одобрено этическим комитетом университета. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (5 МЕ/мл). Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием (15 мин при 3000 об/мин), клетки трижды отмывали в изотоническом растворе хлорида натрия, содержавшем глюкозу (5.0 мМ), и ресуспендиро-вали в буферном растворе (138 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1 мМ K2SO4, 7.5 мМ Na2HPO4, 1 мМ MgSO4, 5 мМ глюкозы, рН 7.4) с осмолярностью 300 мОсм/л (Осмометр Fogel ОМ-801, Германия) до гемато-крита 40% для последующей инкубации с препаратами и регистрации деформируемости клеток. В опытах со связыванием ионов кальция в среду инкубации добавляли хелатор ЕGTA (1.0 мМ).

Моделирование влияния cAMP как вторичного посредника на микрореологические свойства эритроцитов. Для анализа роли внутриклеточной ре-гуляторной системы "аденилатциклаза—cAMP" в изменениях микрореологических свойств эритроцитов клетки инкубировали в течение 15 мин при 37°С с каждым из перечисленных ниже соединений:

1) со стимуляторами аденилатциклазы (АЦ) форсколином (10-5 М) и проникающим аналогом циклического АМР (db-cAMP, 5 х 10-5 М);

2) с селективными ингибиторами активности фосфодиэстераз (ФДЭ): винпоцетином (10-5 М) — ингибитором ФДЭ-1; цилостазолом (10-5 М) — ингибитором ФДЭ-3; ролипрамом (10-5 М) — ингибитором ФДЭ-4 и изобутилметилксантином (ИБМК, 10-4 М) — неселективным ингибитором ФДЭ.

Моделирование изменений кальциевого ионного обмена эритроцитов. Для повышения внутриклеточной концентрации кальция в эритроцитах их инкубировали в среде, содержащей:

1) 50, 100 или 200 мкМ хлорида кальция (Са2+);

2) стимуляторы входа Са2+ в клетку — кальциевый ионофор А23187 (3 х 10-6 М) или фторид натрия (10-3 М);

3) ингибитор Са2+-АТР-азы — ванадат натрия (10-4 М).

Для снижения внутриклеточной концентрации кальция в эритроцитах их инкубировали в среде, содержащей:

1) блокаторы кальциевых каналов — верапамил (10-5 М) или нифедипин (2 х 10-5 М);

2) хелатор внутриклеточного Са2+ ВАРТА-АМ (1,2-бис(2-аминофенокси)этан^^^^-тетра-уксусная кислота, 6.5 х 10-5 М ). ВАРТА-АМ проходит через мембрану и гидролизуется до ВАРТА внутриклеточными ферментами.

3) ингибитор кальций-зависимых К+-каналов (Гардош-эффект) клотримазол (10-5 М).

Исходные растворы добавляемых препаратов готовили в DMSO (форсколин, ИБМК, А23187) или в воде (верапамил, ванадат натрия, винпоце-тин, ролипрам, цилостазол, клотримазол, фторид натрия, ВАРТА-АМ). Препараты были получены от фирмы $1§та-АЫг1сИ (США).

Эритроциты инкубировали с растворами указанных веществ (за исключением ВАРТА-АМ) в течение 15 мин при 37°С. Длительность инкубации клеток в присутствии ВАРТА-АМ составляла 40 мин. Контрольной пробой служила суспензия эритроцитов (гематокрит 40%), подвергавшаяся аналогичной по продолжительности инкубации при 37°С в буферном растворе без добавления препаратов. Все измерения были выполнены в течение 4 ч после взятия крови.

Для оценки влияния Са2+ на микрореологические свойства эритроцитов в условиях сдвиговой деформации мембран использовали модель механического стресса эритроцитов [1]. Суспензию эритроцитов (гематокрит 1.0%) пропускали под большим, строго дозированным давлением через узкий канал (иглу шприца). Механический стресс эритроцитов проводили как в отсутствие кальция в среде, так и при его добавлении в концентрации 50 мкМ.

Деформируемость эритроцитов измеряли двумя способами. 1) Регистрировали вязкость суспензий эритроцитов с гематокритом 40% на полуавтоматическом капиллярном вискозиметре при шести напряжениях сдвига (от 0.20 до 2.00 Н • м-2). Все измерения выполнены при температуре 20.0 ± 0.2°С (в помещении лаборатории проводили кондиционирование воздуха для поддержания его постоянной температуры и влажности). Вязкость суспензионной среды (буферный раствор) была постоянной и составляла 1.10 мПас. Коэффициент вариации при измерении вязкости не превышал 1.0%. Таким образом оценивали общую деформацию клеток в сдвиговом потоке [4, 13]. 2) Опреде-

Рис. 1. Изображение эритроцитов в микрокамере: а — в состоянии покоя до приложения сдвигового напряжения; б — вытянутая потоком клетка, прикрепленная ко дну микрокамеры "одной точкой"; в — иллюстрация расчета индекса удлинения эритроцита в микрокамере [4]; г — удлинение эритроцитов в потоке (стрелкой показано направление течения в микрокамере).

ляли индекс удлинения отдельных эритроцитов (ИУЭ) [4] в проточной микрокамере. Камеру заполняли разбавленной суспензией эритроцитов (гематокрит 0.5%) в изотоническом растворе NaCl, содержащем 5.0 мМ глюкозы, и помещали на предметный столик микроскопа. В течение 5 мин суспензия эритроцитов была неподвижной в камере и значительная часть клеток (несколько сотен) оседала на дно и прикреплялась к несили-конизированной поверхности небольшим фрагментом мембраны. В микрокамеру подавали давление, которое создавало в ней определенное, контролируемое при помощи сервомеханизма, напряжение сдвига. Под действием этого давления эритроциты деформировались, вытягиваясь в направлении течения (рис. 1). На основе измерения длины (L) и ширины (W) вытянутых потом клеток рассчитывали ИУЭ: ИУЭ = (L - W)/(L + W). Обработку изображения и расчет индекса ДЭ проводили с помощью специально написанной компьютерной программы.

Гематокрит определяли при помощи микроге-матокритной центрифуги Elmi СМ-70. Содержание ионов кальция в эритроцитах оценивали микрофлуориметрическим методом. Использовали конфокальный микроскоп Nikon DIGITAL ECLIPSE C1 plus и кальциевый зонд Calcium Green-1 (Molecular probes, Inc). Кальциевый зонд (2.5 x 10-5 г/л) вводили в 10% суспензию эритроцитов в изотоническом растворе NaCl и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Длины волн возбуждающего света и эмиссии флуоресценции составляли, соответственно, 506 и 531 нм. Для иммобилизации клеток в процессе сканирования под микроскопом применяли кюветы с полили-зиновым покрытием. Кон

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»