ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2004, № 2, с. 214-223
^ БИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^
ПОЧВ
УДК 631.46
РОСТ ПРОКАРИОТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕННЫХ СУСПЕНЗИЯХ ИЗ РАЗНЫХ ТИПОВ ПОЧВ*
© 2004 г. А. М. Полянский1, А. В. Головченко2, Л. М. Полянская1, В. С. Гузев1, Д. Г. Звягинцев1
1Факулътет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119899, Москва, Воробьевы горы 2Институт проблем экологии и эволюции им. АН. Северцова РАН, Институт почвоведения МГУ-РАН
Поступила в редакцию 07.04.2003 г.
Характер роста численности прокариотных микроорганизмов, время удвоения и динамика роста численности бактерий и длины актиномицентного мицелия могут быть использованы для характеристики разных почв, их горизонтов и выявления жизнеспособности прокариотных микроорганизмов в них.
В ходе сезонной сукцессии в почве происходят постоянный рост и отмирание почвенных микроорганизмов. Сменяют друг друга доминирующие популяции, происходят существенные флуктуации общей численности микробов. Общий учет численности микроорганизмов в почве связан с большими методическими трудностями и преимущества различных подходов здесь до настоящего времени являются предметом дискуссии. Все еще достаточно популярны оценки общей численности микроорганизмов в почве с помощью посева на плотные питательные среды. При этом имеются огромные различия между данными, полученными с помощью посева, и данными, полученными прямыми микроскопическими методами. Все больше исследователей склоняются к мнению о предпочтительности прямых микроскопических методов учета.
Изучение прямыми микроскопическими методами численности и биомассы микроорганизмов в почве и особенно динамики этих показателей по сезонам является актуальным направлением современной почвенной микробиологии. Однако, изучая динамику численности различных групп микроорганизмов, исследователь оказывается перед необходимостью оценивать соотношение живых и мертвых клеток.
Для оценки потоков основных биогенных элементов и общего энергетического баланса почв необходимо знать, какая часть учитываемой микробной биомассы является жизнеспособной, а какая - только потенциальным субстратом в каждый данный момент времени. Большое самостоятельное значение имеет вопрос о скорости реутилизации отмирающей микробной биомассы.
*
Работа выполнена при финансировании грантов РФФИ
< 01-04-48031, 03-04-48620 и 04-04-48640.
До настоящего времени не предложено надежного прямого метода дифференцированного учета живых и мертвых микроорганизмов в природных местообитаниях. Диапазон предлагающих методов дифференциации живых и мертвых прокариотных микроорганизмов не так широк. В первую очередь используются различные методы окрашивания [7, 9, 14, 16, 18-20]. Существуют также различные приемы оценки жизнеспособности прокариотных пропагул по критериям термотолерантности и устойчивости к ультразвуковому воздействию [4, 5]. При изучении соответствующей литературы обращает на себя внимание огромный разброс в оценках соотношения в почве живой и мертвой биомассы прокариотных микроорганизмов [20]. Существующие среди исследователей разногласия свидетельствуют об актуальности дальнейшего совершенствования приемов учета живых и мертвых прокариотных микроорганизмов в почве.
На основе предложенного нами и широко апробированного метода прямого учета эукариот-ной микробной биомассы в различных почвенных местообитаниях [6, 11-13] был разработан метод дифференциации живой и мертвой грибной биомассы на основе роста грибных пропагул в почвенных суспензиях на препаратах для микро-скопирования [2, 14]. С помощью этого метода было установлено, что большая часть учитываемой с помощью микроскопии грибной биомассы в почвах жизнеспособна. Разные почвы различаются по соотношению численности живой и мертвой грибной биомассы, но особенно значимы различия по этому показателю между органогенными и минеральными горизонтами почв. Именно в минеральных горизонтах происходит накопление мертвой грибной биомассы, и ее доля здесь может достигать 50% от общего содержания грибов.
По аналогии с разработанной методикой определения жизнеспособности мицелия и спор грибов мы предложили методику, позволяющую оценить скорость роста прокариотных микроорганизмов в почвенных суспензиях [15]. Цель настоящей работы оценить скорость роста прокариотных микроорганизмов в почвенных суспензиях из разных типов почв. В задачи исследования входило: 1) апробация методики на широком спектре почв; 2) оценка различий почв и почвенных горизонтов по полученным в ходе работы показателям.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализировали гумусовые (А) и минеральные (В, С) горизонты почв Забайкалья [1, 10], которые можно отнести к двум группам. Первая представляла собой сопряженный ряд почв, расположенных по катене (от первой надпойменной террасы р. Селенги до склонов гор и увалов под лесом): луговая - под типичным лугом на первой надпойменной террасе реки Селенги; лугово-ка-штановая - на второй надпойменной террасе под лугово-степной растительностью; каштановая -на южных склонах гор и увалов под сухостепной растительностью; дерново-лесная - на северных склонах гор под сосновым лесом и редким лесным разнотравьем. Вторая группа включала каштановые почвы, представляющие собой различные варианты землепользования: целину, пашню, лесополосу.
В качестве основного приема предварительной обработки образцов для микробиологического анализа использовали ультразвуковое диспергирование на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (22 кГц, 0.44 А, 2 мин) [8].
Общее количество микроорганизмов определяли с помощью метода люминесцентной микроскопии. Препараты готовили обычным способом [8]. Суспензии образцов почвы наносили микропипеткой на тщательно обезжиренные предметные стекла (0.01 мл на препарат для бактерий, 0.02 мл на препарат для грибов) и равномерно распределяли петлей на площади 4 см2. Фиксирование препаратов на пламени горелки проводили после полного их высыхания. Для одного образца готовили 12 препаратов. Препараты для подсчета бактерий и мицелия актиномицетов окрашивали раствором акридина оранжевого (1 : 10000, в течение 2-3 мин). Расчет количества клеток (мицелия) на 1 г почвы проводили по формуле:
N = ап/V £2 с,
где N - число клеток (длина мицелия, мкм) на 1 г почвы; - площадь препарата (мкм2); а - количество клеток, длина мицелия (мкм) в одном поле
зрения (усреднение производится по всем препаратам); п - показатель разведения почвенной суспензии, мл; V - объем капли, наносимой на стекло, мл; £2 - площадь поля зрения микроскопа, мкм2; с - навеска почвы, г.
Для установления репродуктивной способности бактерий и актиномицетного мицелия приготовленные препараты до высыхания мазков помещали во влажную камеру и инкубировали при температуре воздуха 28°С и относительной влажности 100% в течение 6, 10, 18, 23, 36 (39) и 48 часов [15]. После инкубирования препараты высушивали на воздухе, фиксировали и окрашивали акридином оранжевым. Контролем служили препараты, зафиксированные и окрашенные сразу после приготовления мазков. Предлагаемая методика позволяет оценить скорость роста бактерий и актиномицетных пропагул.
Вычисляли удельную скорость роста ц: ц = = (^ - - t)N, где N - исходная численность бактерий, ^ - численность бактерий после инкубации, t - начальное время опыта, t1 - конечное время опыта.
Для выявления таксономической структуры бактериальных сообществ гумусовых и минеральных горизонтов исследуемых почв использовали модифицированную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду [3]. Посев проводили в 5-кратной повторности из экспериментально подбираемых разведений. Посевы инкубировали при 20°С в течение 2-3 недель. Проводили дифференцированный учет колоний бактерий разных таксономических групп. Для этого первоначально на каждой чашке выделяли макроморфологические типы колоний и подсчитывали количество колоний каждого типа. По 3-5 представителей из каждого типа колоний выделяли в чистую культуру. Идентификацию выделенных штаммов до рода проводили на основании морфологических, куль-туральных и хемотаксономических признаков, используя определители [17].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ 81а1§гарЫс8 и 81аи$иса. Для численности бактерий доля среднего квадратического отклонения (5П - х) не превышала 5%, для актиномицетного мицелия - 10%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показана динамика роста бактериальных клеток и актиномицетного мицелия (образование микроколоний) в течение 48 ч, что является наглядной иллюстрацией предложенного метода.
Вычисляли удельную скорость роста прокариотных микроорганизмов, наблюдали за ее дина-
Таблица 1. Дифференцирующие показатели исследуемых почв Забайкалья 1-й группы
Показатель Горизонт, Каштановая Лугово-кашта- Луговая почва Дерново-лесная
время почва новая почва почва
Характер роста численности А экспоненци- экспоненци- экспоненци- экспоненци-
бактерий альный альный альный альный
В » » линейный »
Удвоение численности А через 10 ч через 10 ч через 10 ч через 10 ч
бактерий
В » » через 6 ч через 6 ч
Динамика роста численности 0-6 ч 0.2 0.2 0.1 0.03
бактериальных клеток
в различные промежутки 6-10 ч » » » 0.20
времени в гор. А (ч-1)
10-18 ч 0.1 0.1 » »
18-24 ч » » » 0.1
24-39 ч » » » »
Динамика роста численности 0-6 ч » » 0.3 0.2
бактериальных клеток
в различные промежутки 6-10 ч » » 0.1 0.2
времени в гор. В (ч-1)
10-18 ч » » 0.05 »
18-24 ч » » » 0.1
24-39 ч » » » »
Рост численности бактерий А 0.4 0.3 0.2 0.4
в интервале 0-39 часов (ч-1)
В 0.2 0.3 0.25 0.6
Характер роста А экспоненци- линейный экспоненци- экспоненци-
актиномицетного мицелия альный альный альный
В » » линейный линейный
Рост длины мицелия А 0.60 0.8 0.30 0.3
в интервале 0-24 часа (ч-1)
В 0.40 0.3 0.20 0.2
микой; определяли характер роста и время удвоения численности бактерий и т.д.
Дифференциацию почв проводили по следующим показателям: характер роста численности бактерий и актиномицетного мицелия; время удвоения численности бактерий; динамика роста численности бактериальных клеток в различные промежутки времени в гумусо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.