БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 10, с. 739 - 751
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.112.083
С-РЕАКТИВНЫИ БЕЛОК: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И СПОСОБЫ ЕГО ВЫДЕЛЕНИЯ
© 1995 г. Е. Г. Зотова* Е. Б. Мысякин, С. Ж. Токсамбаева, К. С. Рубцов*, Г. А. Серебренникова**
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН,
123098, Москва, ул. Гамалеи, 18; *'Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; **Московская академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, Москва
Поступила в редакцию 16.12.94 г.
В обзоре представлены данные о структуре С-реактивного белка (CRP), его свойствах и биосинтезе. Значительное внимание уделено специфическому связыванию этого белка с так называемыми Са2+-зависимыми и Са2+-независимыми лигандами: фосфохолинсодержащими соединениями, липо-протеинами, хроматином, галактанами, поликатионами и др. Приводятся сведения о взаимодействии CRP с ионами Са2+. Подробно рассмотрены существующие способы его выделения и очистки. Широко освещен метод аффинной хроматографии как наиболее перспективный для получения высокоочищенного CRP.
Ключевые слова: С-реактивный белок, выделение, строение, свойства; лиганды С-реактивного белка.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы внимание исследователей все больше привлекают процессы, развивающиеся в период острой фазы воспаления и представляющие собой комплекс ранних неспецифических защитных реакций организма. Особое место в их ряду занимает сывороточная реакция - чрезвычайно быстрое нарастание концентрации так называемых положительных острофазных протеинов. Среди них наиболее важен для человека С-реактивный белок (CRP), получивший свое название за способность связываться с соматическим полисахаридом клеточной стенки Streptococcus pneumoniae (C-PS).
Концентрация CRP, содержащегося в сыворотке крови здорового человека в следовых количествах, в период острой фазы воспаления может возрастать в 1000 - 2000 раз. В связи с этим наблюдение за содержанием CRP в сыворотке крови или других биологических жидкостях чело-
Сокращения: CRP- С-реактивный белок; SAP - сывороточный амилоид Р; C-PS - соматический полисахарид клеточной стенки' Streptococcus pneumoniae; PC - фосфохолин; PEA - фосфоэтаноламин; BSA - бычий сывороточный .альбумин; LP - липопротеины; LPVLD - липопротеины очень низкой плотности; LPLD - липопротеины низкой плотности; LPHD - липопротеины высокой плотности; ароВ - аполипопротеин В; ароЕ - аполипопротеин Е; PAF - фактор активации тромбоцитов.
* Автор для переписки.
века имеет большое значение для диагностики и прогноза развития воспалительного процесса.
Со времени открытия CRP [1] накоплен огромный фактический материал о его строении [2 - 4], биосинтезе [5 - 7], лигандной специфичности [8 -15], физико-химических [2,16] и биологических [17 -19] свойствах. Несмотря на наличие большого количества обзоров и монографий по этой теме, изданных за рубежом [17 - 26], на русском языке опубликован только один обзор [27], посвященный в основном биологическим свойствам CRP и, естественно, не содержащий информации, полученной в последние годы.
В обзоре большое внимание уделено взаимодействию CRP с различными лигандами, во многом обусловливающему его основные биологические функции. Поскольку проблема разработки наиболее эффективных методов получения высокоочи-щенных препаратов CRP не утратила своей актуальности и сегодня ввиду необходимости изучения свойств и биологических функций CRP, а также создания лечебных препаратов на его основе, значительная часть обзора посвящена способам выделения и очистки CRP.
CRP широко представлен в эволюционном ряду, начиная с беспозвоночных. В зависимости от видовой специфичности отмечены определенные различия его структуры и лигандной специфичности. В данном обзоре основное место отведено CRP человека.
I. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА CRP 1.1. Молекулярная организация CRP
CRP человека - пентамер, состоящий из пяти идентичных негликозилированных и нековалент-но связанных субъединиц [28]. По данным электронной микроскопии [28, 29], нативная молекула CRP образует кольцеобразную дисковую структуру с циклической пентамерной симметрией, составленную из одинаковых субъединиц глобулярной формы. Максимальный диаметр молекулы CRP равен 10 нм, диаметр субъединицы составляет 3.3 им [28]. Белки с подобной достаточно редкой структурой принадлежат к так называемому семейству пентаксинов [17, 28]. С помощью метода КД было показано, что CRP содержит значительное количество участков с а-сииралью (34%) и ß-складчатой структурой (45%) [2].
Первичная структура CRP была впервые определена путем его секвенирования (187 аминокислот) [3] и впоследствии уточнена при определении последовательности кДНК CRP (206 аминокислот) [4, 30]. Считается, что результаты последних работ более достоверны [4, 17, 30], поэтому в обзоре порядковые номера аминокислот CRP будут соответствовать именно этой последовательности (рисунок). Молекулярная масса субъединицы CRP, рассчитанная исходя из последовательности в 206 аминокислотных остатков, составляет 23 098 Да [17]. Субъединица CRP представляет собой полипептидную цепь, содержащую одну дисульфидную связь, образуемую
1 QTDMSRKAFVFPKESDTSY 20 VSLKAPLTKPLKAFTVCLHF 40 YTELSSTRGYS 1 FSYATKRQ 60 DNEILI FWSKD 1 GYS FTVGG 80 S Е I L F Е V PE VTVAPVH I CTS 100 WESASG I VEFWVDGKPRVRK 120 S LKKGYTVGAEAS 1 I LGQEQ 140 DS FGGNFEGSQS LVGD 1 GNV 160 NMWDF VLS PDEINTIYLGGP 180 F S Р N V L NWR ALKYEVQGEVF 200 TKPQLWP
Аминокислотная последовательность субъединицы
CRP [16, 17].
остатками цистеина в.положениях 36 и 97 [4, 30]. С-Концевым остатком субъединицы CRP является пролин [3, 4]. Сведения относительно N-концевой аминокислоты противоречивы. По данным работы [3] на N-конце субъединицы CRP расположен остаток пироглутаминовой кислоты, а в работах [4, 5] указывается остаток глутамина. Гидрокси-аминокислоты составляют 15% суммарного аминокислотного состава CRP, кислые - 20% [31].
Обнаружено значительное сходство CRP с нуклеоплазмином- белком, обладающим способностью накапливаться в ядре клетки [32]. CRP, как и нуклеоплазмин, состоит из 5 идентичных субъединиц. Субъединицы обоих белков обладают сходной молекулярной массой и близкими изоэлектрическими точками, термостабильны в присутствии ионов Са2+, связываются с гистонами и рибонуклеопротеинами [32]. Нуклеоплазмин содержит специфическую аминокислотную последовательность (так называемый "сигнал локализации в ядре"), которая облегчает проникновение белков с М более 40 кДа из цитоплазмы в ядро. CRP при микроинъекции в живую клетку способен также проникать из цитоплазмы в ядро, что, по-видимому, объясняется наличием в его аминокислотной последовательности аналогичного "сигнала локализации в ядре", представляющего собой богатый лизином участок полипептидной цепи белка: At"g118-Lys-Ser-Leu-Lys-Lys123 [32].
CRP может существовать в виде двух форм, обладающих различными физико-химическими свойствами и функциональными активностями: нативной (пентамерной) и моносубъединичной (нео-CRP) [16,31,33].
Пентамерная и моносубъединичная формы CRP различаются по подвижности в электрофорезе, выполняемом без обработки белка денатурирующими агентами. В присутствии ионов Са2+ дативный CRP движется в сторону катода в область у-глобулинов (у-электрофоретическая подвижность), в то время как нео-CRP - в сторону анода в область а-глобулинов (а-электрофорети-ческая подвижность) [16]. Нативный CRP и его моносубъединичная форма имеют различные изоэлектрические точки: р/ 6.4 и 5.4 соответственно [16] (определение проводилось в отсутствии ионов кальция).
Диссоциация нативной молекулы CRP приводит к потере функции Са2+-зависимого связывания белка с С-PS [16, 31]. Однако при этом сохраняется способность нео-CRP к Са2+-независимому взаимодействию с поликатионами [16].
С помощью моноклональных антител проведено картирование антигенных эпитопов нативной и моносубъединичной форм CRP. Установлено, что пентамерная форма CRP имеет пять эпитопов, а нео-CRP - три эпитопа, один из которых у обеих форм является общим [33]. Таким образом,
выявлены эпитопы, имеющиеся в скрытом виде у нативной молекулы и экспонированные только в случае моносубъединичной формы CRP [33].
В организме нео-CRP обнаруживают ассоциированным с поверхностью периферических лимфоцитов крови [34]. В экспериментальных условиях для получения нео-CRP используют различные приемы. Например, молекула CRP необратимо диссоциирует на субъединицы в растворах с низкой ионной силой и при pH 9.5 [13], -Субъединицы CRP также могут быть получены при диализе раствора белка против 0.1 М трис-бу-фера (pH 9.0) в течение 36 ч [6]. При этом в пен-тамерной форме остается только 10% белка. Изменение pH водного раствора CRP до 2 - 3 также приводит к образованию нео-CRP [35, 36], однако в этом случае только 10% мономера остается растворимым, остальная часть необратимо денатурирует. Образование нео-CRP может быть достигнуто и с помощью многократных циклов замораживания-оттаивания или непродолжительного нагревания раствора CRP при 63°С [17, 36], обработкой CRP 8 М мочевиной в присутствии 10 мМ EDTA [16, 35] или 5 М гуанидин-НС1 [31], а также при инкубации раствора CRP с полисти-рольными шариками [36, 37].
Возможна ли реконструкция нативной молекулы CRP из мономеров и при каких условиях это может произойти - очень важная и интересная проблема, ждущая своего решения.
1.2. Биосинтез CRP
CRP синтезируется в виде белка-предшественника, содержащего сигнальный пептид из 18 аминокислот, отсутствующий у зрелого белка [4, 5]. мРНК CRP человека включает 2200 нуклеотидов [5]. Следует отметить, что размер мРНК в 3 раза больше размера, необходимого для кодирования первичного продукта трансляций - белка-предшественника. Ген, кодирующий синтез CRP, локализован в специфической области хромосомы I человека [17, 38]. Он расположен на расстоянии 7700 п. о. от родственного псевдогена [18,39] и состоит из двух экзонов, разделенных интроном величиной в 278 п. о. [18]. Нуклеотидная последовательность интрона в гене CRP характеризуется достаточно редкой ос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.