ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 3, с. 263-275
УДК 577.122
САЛИЦИЛАТ-ИНДУЦИРОВАННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПРОТЕОМОВ У РАСТЕНИЙ (ОБЗОР)
© 2010 г. И. А. Тарчевский*, **, В. Г. Яковлева**, А. М. Егорова**
* Институт биохимии имени А.Н. Баха, Москва119071 e-mail: inbi@inbi.ras.ru
** Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань 420111
e-mail: tarchevsky@mail.knc.ru Поступила в редакцию 22.09.2009 г.
Дан краткий обзор статей, посвященных модификациям протеомов растений под влиянием салициловой кислоты — одного из основных медиаторов локального и системного иммунитета. Приведены результаты собственных исследований салицилат-индуцированных изменений протеомов листьев и корней гороха. Идентифицировано 15 ранее неизвестных салицилат-индуцируемых белков. В листьях, в отличие от корней, происходило повышение содержания некоторых белков хлоропла-стов и ферментов, разрушающих клеточные стенки патогенов. В корнях салициловая кислота повышала содержание ферментов, укрепляющих устойчивость самих клеток растения и вызывала исчезновение редуктазы оксофитодиеновой кислоты. Последнее могло привести к торможению синтеза жасмоновой кислоты и усилению локального иммунитета. Повышенная ("апоптозная") концентрация салициловой кислоты вызывала усиление синтеза в корнях белков — участников образования гетеробелковых комплексов, играющих важную роль в функционировании сигнальных систем, синтезе и репарации ДНК, синтезе, рефолдинге и протеолизе белков.
Исследованию влияния салициловой кислоты (СК) на растения уделяется большое внимание в связи с тем, что она является одним из ключевых факторов формирования иммунитета при действии патогенов. Было обнаружено, что содержание СК в тканях растений многократно повышается под влиянием патогенов и элиситоров [1]. При действии на растения экзогенной СК наблюдаются как быстрые ответные реакции, вызванные влиянием на активность ферментов, так и медленные, проявляющиеся через несколько часов и дней. К первым относится появление так называемого "окислительного взрыва", вызванного СК-индуцированным подавлением активности каталазы и аскорбатпероксида-зы. Это приводит к накоплению перекиси водорода и других активных форм кислорода, что оказывает подавляющее действие на развитие патогенов и вызывает программируемую клеточную смерть ограниченного числа клеток вокруг места инфекции и, вследствие этого, препятствует распространению патогенов по растению. Причиной медленных ответов клеток является СК-индуцируемое опосредованное сигнальными системами репрограммирова-ние экспрессии генов и синтеза белков. Появление некоторых антипатогенных белков при действии на растения экзогенной СК было обнаружено относительно давно [2], а в последнее время появилась возможность исследовать СК-индуцируемое изменение набора и содержания белков с помощью про-теомного анализа.
Методическая база протеомики включает набор непрерывно совершенствующихся методов анализа белков — разделение с помощью одномерного и двумерного электрофореза в различных диапазонах рН, масс-спектрометрический анализ первичной структуры и идентификация белков [3, 4].
Это позволяет получить информацию о наборе, содержании, посттрансляционных модификациях белков и влиянию на них различных условий существования растений.
С помощью протеомного анализа в последние годы получены новые принципиального характера данные о молекулярных механизмах, лежащих в основе формирования иммунитета растений. Выяснилась особая роль в патогенезе, функционировании сигнальных потоков и в формировании иммунитета посттрансляционных модификаций белков [5] и комплексообразующих белков [6].
Обращает на себя внимание, что при исследовании протеомов и протеомном анализе влияния на растения патогенов, элиситоров и стрессовых фи-тогормонов в качестве объекта исследования использовались главным образом надземные органы растений. Лишь в последние годы были исследованы протеомы корней у ряда растений [7—11]. Основные отличия протеомов корней от протеомов листьев были связаны с отсутствием в корнях фотосинтетической функции, но были также обнаружены различия в наборе и содержании других белков, например, обеспечивающих защиту от патогенов. Немногочисленность исследова-
ний протеомов корней растений вызывает затруднения в идентификации корневых белков, что связано с их низким содержанием и ограниченностью сведений в базах данных о структуре и функциональной принадлежности этих белков [12].
Роль салициловой кислоты в растениях
Роли СК в развитии растений и выработке у них устойчивости к патогенам и неблагоприятным климатическим факторам посвящен ряд обзоров [2, 13—16], однако, нам не известны обзоры, которые были бы специально посвящены влиянию СК на протеомы.
Содержание СК в тканях растений при действии на них патогенов и элиситоров быстро повышается в десятки раз. Происходит так называемый "сали-цилатный взрыв", причинами которого могут быть индуцируемая активация гидролазы, освобождающей салицилат из О-р^-глюкозидсалицилата (локализованного в клеточных стенках), фенилала-нин-аммиаклиазы — ключевого фермента синтеза СК из Ь-фенилаланина, и изохоризматсинтазы, катализирующей (вместе с изохоризмат-пируватлиа-зой) синтез СК из хоризмата [14].
Имеются основания считать, что фенилпропа-ноидный путь отвечает за быстрое образование СК, связанное с гибелью клеток при индукции процесса сверхчувствительности, тогда как более медленный изохоризматный путь важен для поддержания синтеза СК при развитии системного иммунитета [17].
Повышение содержания СК приводит к активации по крайней мере некоторых из сигнальных систем клеток [18]: НАДФН-оксидазной [19], ли-поксигеназной [20], МО-синтазной [21] и МАР-киназной [22]. Это, в свою очередь, вызывает ре-программирование экспрессии генов и синтеза белков — повышение содержания и появление одних белков или снижение содержания и исчезновение — других [18, 23].
Используя классификацию, предложенную для патоген-индуцируемых белков [24, 25], мы подразделили большую часть обнаруженных до настоящего времени СК-индуцируемых белков на следующие функциональные группы:
— белки прямого антипатогенного действия — хитиназы [26—28], дегидрин, р-1,3-глюканаза [29], альфа- и бета-круциферины 128, 128- запасные белки семян [30], тауматинподобный белок [31], основной аллерген вишни Рга Лу [32];
— РЯ-белки и белки теплового шока — РЯ1 [33], РЯ10 [31], БТШ 70 кДа [34, 35], БТШ 20 и БТШ 60 [34];
— антиоксидантные ферменты, оксидоредукта-зы и ферменты, нейтрализующие токсичные соединения — аскорбатпероксидаза [36], глутатион-8-трансфераза [37, 38], пероксиредоксин, глютатион-пероксидаза [32], тиоредоксин, пероксидаза [34];
— белки сигнальных систем — трансмембранный рецептор, супероксиддисмутаза [34], 48 кДа MAP-киназа [39], транскрипционный фактор WRKY [40], ГТФ-связывающий ядерный белок [32], рецептор-подобная киназа, каталаза [32, 34];
— белки, регулирующие протеолиз — убиквитин-подобный белок [32], альфа-субъединица 20S про-теасомы [31], субъединица 11 26S протеасомы [34];
— ферменты дыхания и фотосинтеза — цитохром b5, изоцитратлиаза [30], НАД-зависимая малатде-гидрогеназа, триозофосфатизомераза [32], фосфо-глицерткиназа, фумаратдегидрогеназа, фосфоглице-ратдегидрогеназа, альфа-субъединица митохондри-альной АТФ-синтазы, енолаза, альфа-субъединица НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа, [34] и др.;
— белки цитоскелета — тубулин [30], актинде-полимеризующий фактор [32], изоформа B актина [34];
— комплексообразующие белки — обогащенный лейциновыми повторами белок [31], обогащенный глицином РНК-связывающий белок [34].
Эти сведения о СК-индуцируемых белках относятся к надземным органам растений (листьям, плодам, суспензионным культурам, полученным из тканей надземных органов). Отсутствовала информация о СК-индуцируемых белках корней, в то время как они играют важную роль в индукции иммунитета целого растения. Следует заметить, что практически не уделяется внимания белкам, содержание которых снижается или они исчезают под влиянием СК.
При изучении протеомов предпочтение отдается растениям с расшифрованным геномом — араби-допсису и рису, однако, признается необходимость расширения перечня растений, подвергаемых про-теомному анализу [41—43]. Мы провели исследование влияния СК на растения гороха (Pisum sativum L.) сорт Труженик, уделив особое внимание корням в связи с недостаточной изученностью протеомов корней растений. Объектом исследования служили листья и корни 8-дневных проростков. Выбор объекта определялся тем, что ранее мы использовали его для определения влияния патогенных мико-плазм [24, 44—46] и различных стрессовых гормонов [47—49] на набор и содержание белков и часть из них была уже нами идентифицирована. Наибольшее внимание было уделено сопоставлению влияния СК относительно невысокой концентрации (50 мкМ) на протеомы листьев и корней и действия невысокой (50 мкМ) и "апоптозной" (100 мкМ) концентраций СК на протеомы корней.
В работе использовали 2D-электрофорез и MALDI TOF-масс-спектрометрию. Двумерный электрофорез осуществляли на приборах Protean IEF Cell, Protean II xi 2-D Cell ("Bio-Rad", США) с использованием стрипов 17 см ("Bio-Rad") с иммобилизованным градиентом рН 4—7 и 3—10. Масс-
кДа 664536292421.1 —
14.3 —
К СК
1 2
4
5
7
8
9
10
11 12
13
(в) К СК
Рис. 1. Электрофореграммы растворимых белков листьев проростков гороха. а-контроль; б — фрагменты гелей рН 4—7 контрольного (К) и опытного (СК) вариантов, в — фрагменты гелей рН 3—10. На гель наносили по 400 мкг белка, пластины геля окрашивали Кумасси G-250.
спектры получали на тандемном MALDI скоростном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd). Поиск белков проводили по базе данных NCBI (подбаза-растения). Поиск по результатам MS + MS/MS был проведен с использованием программы Biotools 3.0 ("Bruker Daltonics", Германия). Регистрацию масс-спектров (MS и MS/MS) и идентификацию белков проводили в ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава.
Влияние СК на протеомы листьев.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.