научная статья по теме СЕКРЕТИРУЕМАЯ N-АЦЕТИЛ-Β-D-ГЕКСОЗАМИНИДАЗА МОРСКОГО ГРИБА PHOMA GLOMERATA Химия

Текст научной статьи на тему «СЕКРЕТИРУЕМАЯ N-АЦЕТИЛ-Β-D-ГЕКСОЗАМИНИДАЗА МОРСКОГО ГРИБА PHOMA GLOMERATA»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 520-526

УДК 577.152.321*52

СЕКРЕТИРУЕМАЯ N-АЦЕТИЛ-Р-Б-ГЕКСОЗАМИНИДАЗА МОРСКОГО ГРИБА Phoma glomerata

© 2004 г. Н. В. Журавлёва, П. А. Лукьянов, М. В. Пивкин

Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток, 690022,

e-mail: paluk@mail.ru Поступила в редакцию 18.10.2003 г.

Из 10 штаммов морских грибов отобран перспективный продуцент N-ацетил-Р-В-глюкозаминида-зы мицелиальный гриб Phoma glomerata. Подобраны условия выращивания штамма и биосинтеза фермента. Из культуральной жидкости Phoma glomerata с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, DEAE-Sephacell и гель-фильтрации на Toyopearl HW-55 выделена N-ацетил-Р-D-гексозаминидаза с выходом 35% и степенью очистки 36.4 раза и молекулярной массой 20 кДа. Фермент гомогенен по данным гель-фильтрации и электрофореза с ДДС-Na. Фермент катализировал реакцию трансгликозилирования, выход синтезируемых с его помощью ^ацетил^-глюкоза-мина и ^ацетил^-галактозамина 38 и 46% соответственно.

В настоящее время поиск высокоспецифичных гликозидаз является важной задачей биотехнологии. К-Ацетил-Р-Б-глюкозаминидазы (АГА-аза, КФ 3.2.1.52), обладающие трансгликозилиру-ющей активностью, могут быть использованы в синтезе различных неогликоконъюгатов [1-5] с необходимой специфичностью. В пищевой промышленности гликозидазы применяют для улучшения вкусовых качеств соков и вин [6]. N-Аце-тил-Р-Б-глюкозаминидазы из морского гриба Fo-ma glomerata (Corda) успешно используют как удобный инструмент для определения моносаха-ридной последовательности в гликопротеинах различного строения.

Морские грибы по сравнению с другими экологическими группами грибов мало изучены [7]. Однако в последние годы они привлекают огромный интерес как продуценты новых биологически активных веществ и высокоактивных ферментов, отсутствующих у других видов. Многие работы были посвящены целлюлазам морских грибов [7], в то время как хитинолитические ферменты мало изученны.

Цель работы - отбор продуцентов N-ацетил-Р-D-глюкозаминидазы среди различных штаммов морских грибов, представленных в Коллекции морских микроорганизмов Тихоокеанского института биоорганической химии (КММ ТИБОХ), а также выделение и изучение свойств АГАазы из перспективного продуцента - морского гриба Foma glomerata (Corda) Wollenw. et Hochafel.

МЕТОДИКА

Содержание белка определяли по методу Лоу-ри, восстанавливающие сахара - ферроцианид-ным методом [8].

Электрофорез с ДДС-Ка проводили по методу Лэммли [9], используя 15%-ный разделяющий по-лиакриламидный гель.

Для колоночной хроматографии использовали оборудование фирмы "ЬКВ" (Швеция): коллектор фракций "Зирегаек" 2211, перистальтический насос 2115. Профиль элюции при 206 или 280 нм записывали с помощью проточного спектрофотометра "Иу1еогё" 2158 и двухканального самописца 2210.

ВЭЖХ проводили на хроматографе "вИзои" (Франция), используя насос модели 302, манометрический модуль 802С, смеситель 811, инжектор "ЬКВ" 2154 (Швеция).

В работе использовали химические реагенты марки ч.д.а., х.ч.

Выращивание морских грибов проводили на стандартной среде Тубаки (г/л морской воды): глюкоза - 3.0, КН2Р04 - 1.0, М§Б04 ■ 7Н20 - 0.5, РеБ04 ■ 7Н20 - 0.02, пептон - 1.0, дрожжевой экстракт - 0.5, в течение 7 сут. Для определения ин-дуцибильности ферментов штамм Р. glomerata выращивали на модифицированной среде Тубаки с добавлением 3 г/л коллоидного хитина или заменой глюкозы на коллоидный хитин.

Определение ^ацетил-Р-Б-глюкозаминидаз-ной активности у морских грибов. Биомассу 10 различных штаммов морских грибов отделяли центрифугированием 20 мин при 600 § на центрифуге К-23 (Германия). Надосадочные жидкости замораживали для коагуляции секретируемого

полисахарида, оттаивали и центрифугировали 10 мин при 600 g на настольной центрифуге MPW-310 (Польша). Полученные супернатанты диализовали против дистиллированной воды и определяли их ферментативную активность.

Стандартная реакционная смесь содержала 50 мкл раствора фермента, 50 мкл 0.005 М фосфатного буферного (ФБ) раствора, pH 7.4, и 50 мкл 2 мМ раствора п-нитрофенил-К-ацетил-Р-Б-глю-козаминида (или галактозаминида) ("Serva", Германия). Инкубацию проводили при 37°C в течение 30-60 мин, реакцию останавливали добавлением 50 мкл 0.5 М Na2CO3 и оптическую плотность измеряли при 405 нм в микропланшетном спектрофотометре "Dynatech" MR 600 (Швейцария).

Для 4-метилумбелиферилгликозидов скорость гидролиза определяли по возрастанию флуоресценции отщепляемого 4-метилумбелиферола при 440 нм (возбуждение 360 нм) на спектрофлуоримет-ре "Hitachi"-M850 (Япония). Реакционная смесь содержала 300 мкл раствора фермента (0.0025 мг/мл), 300 мкл ФБ и 300 мкл 0.02 мМ раствора 4-метил-умбелиферил-Р-К-ацетил-Б-глюкозаминида (или галактозаминида).

Скорость ферментативного гидролиза метил-гликозидов определяли по появлению восстанавливающих (ферроцианидный метод) сахаров в пробах, измеряя поглощение при 700 нм на спет-рофотометре "Specol" 211 (Германия).

За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, гидролизующего субстрат с образованием 1 мкмоля п-нитрофено-ла, метилумбелиферола, К-ацетил-Р-Б-глюкоз-амина или К-ацетил-Р-Б-галактозамина за 1 мин. Удельную активность выражали в единицах ферментативной активности на 1 мг белка [10, 11]. Количественно продукты реакции определяли по калибровочным кривым, полученным с использованием соответствующих стандартов.

Очистка ^ацетил-Р-Б-гексозаминидазы. Все

работы проводились при 4-8°С. Культуральную жидкость гриба P. glomerata, выращенного на модифицированной среде Тубаки с добавлением коллоидного хитина в течение 6 сут (7.2 л), замораживали, оттаивали и центрифугировали 20 мин при 600 g на центрифуге К-23 (Германия). Супернатант диализовали против 12 л ФБ в течение 1 сут, дважды меняя диализный раствор. К полученному препарату добавляли 200 г ДЭАЭ-целлюлозы, предварительно уравновешенной ФБ, рН 7.4, перемешивали 10 мин и промывали сорбент от несорбированных белков 0.5 л того же раствора. Фермент элюировали 0.5М NaCl (0.5 л). Полученный элюат диализовали против ФБ, концентрировали до 200 мл на колонке с полыми волокнами P-10 ("Amicon", США) и наносили на колонку DEAE-Sephacell (4.5 х 30 см), уравновешенную в ФБ, рН 7.4. Колонку промывали ФБ для удаления

несвязавшегося белка. Специфическую элюцию проводили в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до 0.5 М в ФБ (по 400 мл). Измеряли поглощение при 280 нм. Фракции, содержащие АГАзу, диализовали против дистиллированной воды и концентрировали.

На колонку (2.6 х 90 см) с Toyopearl HW-55F ("Toyo Soda", Япония), уравновешенную ФБ, наносили 10 мг фермента в 1 мл ФБ. Скорость элю-ции 1 мл/мин. Фракции, содержащие ферментативную активность, собирали по 5 мл, диализовали против дистиллированной воды и высушивали на лиофильной сушке B-67 ("New Brunswick", США)

Определение молекулярной массы проводили методом гель-фильтрации. На колонку Toyopearl HW-55F, уравновешенную ФБ, наносили 0.5 мг фермента в 0.2 мл. Скорость элюции 0.5 мл/мин, фракции собирали по 1 мл. В качестве маркеров использовали (кДа): декстран голубой (2000), овальбумин (43), карбоксиангидразу (29), цито-хром с (12.4) ("Serva", Германия). Молекулярную массу рассчитывали по формуле lnM = (Ve - Vo)/Vo, где Ve - объем элюции белков, Vo - объем элюции декстрана голубого.

Оптимум рН. К 20 мкл фермента (0.25 мг/мл) добавляли 80 мкл 0.1 М трис-цитратного буфера (рН от 1.5 до 10.5) и 100 мкл 2 мМ раствор п-нитро-фенил-Р^-ацетил-Б-глюкозаминида. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 0.5 М Na2CO3. За 100% принимали активность фермента при рН 7.4.

Стабильность при различных рН. К 20 мкл фермента (0.25 мг/мл) добавляли 40 мкл 0.1 М трис-цитратного буфера с различными значениями pH. Растворы выдерживали 12 ч при температуре 4°С и нейтрализовали добавлением 160 мкл 0.05 М фосфата натрия, рН 7.4. Остаточную активность определяли как описано выше. За 100% принимали активность фермента при рН 7.4.

Термостабильность. Раствор фермента (по 100 мкл, 0.25 мг/мл) выдерживали при температурах от 4°С до 100°С в течение 30 мин. После быстрого охлаждения во льду определяли остаточную активность. Активность при 4°С принимали за 100%.

Влияние ионов двухвалентных металлов.

К 20 мкл фермента (0.25 мг/мл) добавляли 20 мкл 0.1 М раствора солей двухвалентных металлов или ЭДТА, 60 мкл трис-HCl, рН 7.2, и 100 мкл 2 мМ раствора субстрата. Выдерживали при температуре 37°С в течение 30 мин и определяли остаточную ферментативную активность. За 100% принимали активность фермента без эффекторов. С небольшими модификациями проводили опыты, демонстрирующие влияние на ферментативную активность других эффекторов - N-ацетил-Б-глю-козамина, глюкозы, галактозы (в концентрации от 0 до 0.7 М); метанола, mpem-бутанола, ацетонит-

Таблица 1. Динамика накопления АГАазы в процессе роста морского гриба P. glomerata

Активность, ед./мл

Время, сут глюкоза хитин + глюкоза хитин

4 7.3 5.4 7.8

5 8.2 6.7 10.6

6 9.8 8.0 13.3

7 7.8 6.7 10.6

13 2.9 4.5 5.1

рила, диоксана, полиэтиленгликолей 200 и 300 (от 0 до 50%).

Влияние трет-бутанола и метанола при длительном инкубировании. К 300 мкл 40%-ного метанола (или mpem-бутанола) в ФБ добавляли 300 мкл АГАазы (0.25 мг/мл) и оставляли при комнатной температуре (17°С). Аликвоты (50 мкл) отбирались в течение 5 сут для определения активности. За 100% принимали активность АГАзы без добавления растворителей.

Определение трансгликозилирующей активности. К-ацетил-Б-глюкозамин или галактоз-амин (20 мг) растворяли в 200 мкл ФБ, добавляли метанол (200 мкл) и АГАазу (0.25 мг в 600 мкл). Инкубацию проводили при 37°С в течение 1 нед. Аликвоту (500 мкл) помещали на 3 мин в кипящую водяную баню, обессоливали с помощью ка-тионита Dowex-50w (Н+-форма) и анионита Am-berlite CG-400 II (OH- форма) и центрифугировали в течение 20 мин при 2000 g.

Анализ реакционной смеси (0.1 мл) проводили с помощью ВЭЖХ на колонке (4 х 250 мм) Sepa-ron SGX RPS C18, 10 микрон ("Chemapol", Чехия) с предколонкой силосорб С18 4 х 40 мм, 10 микрон ("Chemapol",

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком