УДК 577.152.34.042
СЕКРЕЦИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ТРЕМЯ ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООГАНИЗМАМИ
© 2013 г. Н. Н. Кудрявцева, А. В. Софьин, Т. А. Ревина, Е. Л. Гвоздева,
Е. В. Иевлева, Т. А. Валуева
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва 119071, e-mail: valueva@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 20.02.2013 г.
Изучены сериновые протеиназы, продуцируемые тремя фитопатогенными микроорганизмами, принадлежащими к различным семействам грибов и поражающими растения картофеля. Показано, что оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary и грибы Rhizoctonia solani и Fusarium culmorum сек-ретируют сериновые протеиназы. Анализ субстратной специфичности и чувствительности к действию синтетических и белковых ингибиторов позволил отнести их к трипсино- и субтилизинопо-добным ферментам. Соотношение трипсиноподобных и субтилизиноподобных протеиназ зависело от состава культуральной среды, особенно от формы азотного питания. Филогенетический анализ показал, что, в отличие от базидиомицета R. solani, аскомицет F. culmorum и оомицет P. infestans продуцируют сходные по составу экзопротеиназы, несмотря на то что они являются более дальними родственниками. Это указывает на то, что секреция сериновых протеиназ различными фитопато-генными микроорганизмами зависит не только от условий окружающей среды, но и их филогенетического положения. Полученные данные позволяют предположить, что экзопротеиназы фитопа-тогенных грибов играют различную роль в патогенезе. С одной стороны, они могут способствовать адаптации гриба при увеличении диапазона растений-хозяев, а с другой — выполнять различные функции при его выживании в экологических местах обитания вне растения-хозяина.
DOI: 10.7868/S0555109913050073
Фитопатогенные грибы и оомицеты являются возбудителями многих самых разрушительных болезней растений, которые приводят каждый год к очень значительным потерям урожая во всем мире. В настоящее время описано примерно 100000 видов грибов и оомицетов, но только очень малая часть из них является патогенной [1]. Тем не менее филогенетические исследования показали, что болезнетворные патогены не обязательно тесно связаны друг с другом. На самом деле они распространены во всех таксономических группах грибов, часто показывая тесную эволюционную связь с непатогенными видами [2]. Весьма вероятно, что фитопатогенность изменялась много раз в течение эволюции грибов и оомицетов [2]. В последние годы проводятся интенсивные исследования генов, ответственных за патогенность микроорганизма и его внедрение в растение [3], которые отсутствуют у сапрофитов. Так, гены, которые необходимы для успешного завершения жизненного цикла патогенов, но необязательны для роста сапрофитов, рассматриваются как патогенные факторы [3].
Было показано, что, несмотря на различное происхождение и разные положения на филогенетическом дереве истинных грибов и оомицетов [4], они секретируют ряд белков, известных как эффекторы, которые важны для инфицирования
растения-хозяина [2]. Эти белки могут блокировать защитную систему растения и повреждать его клеточные стенки, обеспечивая вторжение патогена. Они включают в себя ряд секретируе-мых протеиназ, транскрипционные факторы и компоненты каскада передачи сигналов. Экзо-протеиназы, продуцируемые мицелием грибов, могут осуществлять как снабжение патогена питанием, так и играть специфическую роль в клеточном метаболизме. Гены, кодирующие протеи-назы и пептидазы, обнаружены в геномах ряда фитопатогенов. Они могут определять патоген-ность или вирулентность микроорганизма [3].
Все известные протеиназы в соответствии с природой функциональных групп в активном центре распределены на шесть основных классов: сериновые, цистеиновые, треониновые, аспартат-ные, глутаматные и металлопептидазы. Экстрацел-люлярные протеолитические ферменты грибов представлены в основном сериновыми пептидаза-ми, которые включают семейство химотрипсина (81) и субтилизина (88) [5]. Семейство 81 включает химотрипсины из подсемейства 81А, которые распространены в основном у животных и реже в грибах, и трипсины, большинство из которых найдены у грибов. В ряде исследований было показано, что для патогенов растений характерна секреция трип-синоподобных ферментов, в то время как сапро-
фиты продуцируют преимущественно субтилизи-ноподобные ферменты [6—8]. В последствии только у фитопатогенных грибов были обнаружены гены, кодирующие трипсиноподобные проте-иназы [9, 10].
Цель работы — сравнительный анализ серино-вых протеиназ, продуцируемых мицелием трех патогенных микроорганизмов, которые вызывают заболевания картофеля: Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, Rhizoctonia solani Kuhn и Fusarium culmorum (W. G. Sm.) Sacc.
МЕТОДИКА
В работе использовали оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary и грибы Rhizoctonia solani Kuhn (AG-3) 153 и Fusarium culmorum (W. G. Sm.) Sacc., которые были любезно предоставлены Национальным практическим центром по картофелеводству и овощеводству Национальной Академии Наук Республики Беларусь. Культуры выращивали на овсяно-агаровой среде с добавлением термостабильных белков картофеля в течение 11— 14 сут при комнатной температуре (21°C). Среди ряда культуральных сред были выбраны те, в которых наблюдался максимальный рост микроорганизмов, секретирующих протеолитические ферменты. Выбраны следующие среды: среда I содержала на 100 мл KH2PO4 (0.15 г), MgS04 • 7H2O2 (0.025 г), FeSO4 • 7H2O2 (1 мг), тиамин (1 мг), рибофлавин (1 мг) и термостабильные белки из клубней картофеля; среда II представляла собой среду I, в которую был добавлен дрожжевой экстракт (1 г).
Микроорганизмы выращивали в колбах Эрлен-мейера (500 мл), в которые вносили по 150 мл куль-туральной среды. В среду вводили 15 мл суспензии каждой культуры. P. infestans было 2 х 105 зооспор/мл, F. culmorum — 2 х 105 макроконидий/мл и R.. solani — 15 мл мицелия. После 12 сут роста мицелий собирали на фильтровальную бумагу ватман № 41, промывали небольшим количеством теплой дистиллированной воды, нагревали в течение ночи в духовом шкафу при температуре около 90°С, охлаждали в эксикаторе и взвешивали. После более длительного периода сушки не наблюдали дополнительной потери веса. Фильтрат, полученный после сбора мицелия, использовали для анализа секретируемых ферментов.
Белки из фильтрата после 12 сут роста микроорганизмов осаждали (NH4)2SO4 (80% насыщения). Осадок отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин при 4°C, растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды, обессоливали гель-хроматографией на Се-фадексе G-25 и лиофильно высушивали.
Протеолитическую активность ферментов определяли по методу Кунитца [11], используя в каче-
стве субстратов казеин (1%-ный раствор), гемоглобин (0.5%-ный раствор), а также азоказеин (0.5%-ный раствор) [12]. Время гидролиза азоказе-ина составляло 30 мин, а казеина и гемоглобина — 1 ч. Активность цистеиновых протеиназ оценивали после инкубации в присутствии 25 мМ L-цистеина и 1 мМ ЭДТА в течение 10 мин в соответствии с модифицированным методом Куница. За одну единицу протеолитической активности (Е) принимали то количество фермента, которое приводит к увеличению оптической плотности на 0.1 при 366 нм (для азоказеина) и 280 нм (для казеина и гемоглобина) в течение 1 мин.
Амидазную активность ферментов определяли по методу Эрлангера и соавт. [13] с использованием синтетических п-нитроанилидов: Na-бензоил-L-аргинина (БАПА), ^сукцинил-глицил-глицил^-фенилаланина (СукГГФПА), ^карбобензокси^-аланил^-аланил^-лейцина (КбзААЛПА), лейцина (ЛПА) и ацетил-L-аланил-L-аланил-L-аланина (АцАААПА). Концентрация субстрата составляла 0.5 мМ. За одну единицу амидазной активности (АЕ) принимали количество фермента, которое расщепляло 1 нмоль субстрата в 1 мин.
Для проведения ингибиторного анализа были использованы следующие ингибиторы протеолити-ческих ферментов: йодацетамид (ИАА, 1 мМ), хлор-метилкетон тозил^-лизина (ХМКТЛ, 1 мМ), хлор-метилкетон тозил^-фенилаланина (ХМКТФ, 1мМ), диизопропилфторфосфат (ДИПФФ, 1 мМ); ЭДТА (4.0 мМ), дитиотриэтол (ДТТ, 1 мМ), фенил-аланинметансульфонилфторид (ПМСФ, 1 мМ), я-хлормеркурийбензоат (ПХМБ, 0.2 мМ).
Электрофорез в 20%-ном ПААГ в присутствии ДДС-№ (ДДС-ПААГ) и Р-меркаптоэтанола проводили по методу Лэммли [14]. Гели окрашивали 0.1%-ным раствором Кумасси R-250 в 20%-ном этаноле, содержащем 5% формальдегида.
ДДС-ПААГ-электорофорез проводили также в присутствии сополимеризованного субстрата (0.1%-ная желатина) по методу Хеуссен и Даудл [15)]. На дорожку наносили 0.010—0.015 мг белков, выделенных из культуральной жидкости. После электрофоретического разделения белков гель инкубировали в 2.5%-ном растворе тритона Х-100 в течение 2 ч при интенсивном перемешивании для удаления ДДС-№ и восстановления активности ферментов. Реакцию гидролиза желатины разделенными фракциями осуществляли, инкубируя гель в 0.1 М глицин-НС1 буфере, рН 8.3, в течение ночи при комнатной температуре. Затем гель окрашивали 0.1%-ным раствором ами-дочерного в течение 1 ч и избыток красителя отмывали смесью этанол—уксусная кислота—вода (3 : 1 : 6). Компоненты, обладающие протеолити-ческой активностью, выявлялись как бесцветные зоны на голубом фоне окрашенной желатины.
Содержание белка определяли по модифицированному методу Брэдфорд, используя в качестве стандарта БСА [16].
Все эксперименты и анализы проводились, по крайней мере, в трех повторностях, и результаты представлены в виде средних значений, полученных с указанием стандартного отклонения.
В работе использовали казеин (НПО "Био-лар", Латвия), азоказеин, гемоглобин, синтетические субстраты и ингибиторы ("Sigma Chemicals Co", США), сефадекс G-25 и набор низкомолекулярных белков-маркеров (LMW Calibration Kit) фирмы "Pharmacia" (Швеция).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии экспериментов было изучено влияние нескольких факторов (рН среды, концентрация неорганического азота) на секрецию внеклеточных протеиназ фитопатогенами P. infestans (Mont.) de Bary, R. solani, и F. culmorum, которые на филогенетическом дереве, представленном на рис. 1, I, занимают различные ветви. Так, истинные гр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.