научная статья по теме СЕЛЕКТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ГИППОКАМПА К ИНТЕРОЦЕПТИВНОМУ СТРЕССУ: ВЛИЯНИЕ НА ИНТЕРЛЕЙКИН-1? И ЭРИТРОПОЭТИН Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «СЕЛЕКТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ГИППОКАМПА К ИНТЕРОЦЕПТИВНОМУ СТРЕССУ: ВЛИЯНИЕ НА ИНТЕРЛЕЙКИН-1? И ЭРИТРОПОЭТИН»

НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 3, с. 216-219

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 577.352

СЕЛЕКТИВНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ГИППОКАМПА

К ИНТЕРОЦЕПТИВНОМУ СТРЕССУ: ВЛИЯНИЕ НА ИНТЕРЛЕЙКИН-1Р И ЭРИТРОПОЭТИН

© 2011 г. А. К. Пискунов*, А. А. Яковлев, М. Ю. Степаничев, М. В. Онуфриев, Н. В. Гуляева

Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии,

РАН, Москва

Феномен избирательной чувствительности гиппокампа к повреждающим воздействиям экстремального характера, ишемии, гипоксии, метаболическому стрессу широко описан в литературе, однако вопрос о существовании избирательной чувствительности гиппокампа к острому интероцеп-тивному стрессу остается не исследованным. В данной работе проведено исследование динамики нейровоспаления в ответ на системное введение бактериального ЛПС в высокой дозе. Определяли содержание провоспалительного цитокина интерлейкина-ф и экспрессию цитопротекторного белка эритропоэтина в новой коре и гиппокампе, а также корреляции между этими показателями. Показано, что интероцептивный стресс вызывает быстрый воспалительный ответ нервной ткани, имеющий, по-видимому, адаптивный характер. Затем нейровоспаление угасает в коре больших полушарий, но усиливается в гиппокампе, что, по всей видимости, отражает дезадаптивный на данном этапе характер воспаления в этой структуре.

Ключевые слова: липополисахарид, мозг, гиппокамп, нейровоспаление, адаптация, интерлейкин-1 в, эритропоэтин.

Известно, что гиппокамп наиболее чувствителен к различного рода повреждающим воздействиям, в том числе гипоксии [1], ишемии [2], оксидативному [3] и метаболическому стрессу [4]. Механизмы, лежащие в основе этого феномена, до конца не изучены, несмотря на то, что их огромный практический и теоретический интерес привлекает к этой проблеме постоянное внимание исследователей. В качестве возможных причин селективной чувствительности рассматривали особенности кровоснабжения гиппокампа, особенности экспрессии и функционирования глутаматных рецепторов гиппокампа [2], глюкокортикоидных рецепторов гиппокампа [5] и др. Однако в настоящее время остается неясным, имеется ли общее звено нейрохимических механизмов, приводящих к нейродегенерации в гиппокампе при дйствии повреждающих стимулов различной природы.

Очевидно, что в основе повреждения нервной ткани в самых различных условиях лежит недостаточность эндогенных адаптивных механизмов или их абберантная реализация [6]. Данные последних лет показали, что одной из основных универсальных реакций нервной ткани, имеющей на определенном этапе выраженную защитную функцию, является нейровоспаление [7].

* Адресат для корреспонденции: 117485 Москва, ул. Бутлерова, д. 5а; e-mail: 1830255@gmail.com.

Целью настоящей работы было выяснить, является ли гиппокамп избирательно чувствительным при развитии нейровоспаления, используя на первом этапе простой экспериментальный подход. Нейровоспаление — следствие интроцептивного стресса, вызванного интраперитониальным введением бактериального липополисахарида (ЛПС). В качестве показателей нейровоспаления были использованы уровень провоспалительного интер-лейкина-1р (ИЛ-1р) и экспрессия цитопротекторного белка эритропоэтина (Эпо) в новой коре и гиппокампе. ИЛ-1р — один из ключевых медиаторов воспалительного ответа мозга [7], а Эпо — один из основных эндогенных нейропротекторов, вовлеченных в нейровоспаление [7], экспрессия которого положительно регулируется интерлейкином-1. Поэтому уровень Эпо и характер его корреляционных связей с ИЛ-1р, в определенной степени отражает адаптивную или дезадаптивную направленность воспалительного ответа мозга.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали 15 самцов крыс линии ^з1аг массой 400—450 г из питомника "Столбовая". Животных содержали в условиях 12-часового светового цикла при свободном доступе к воде и пище по 5 особей в клетке. Экспериментальные группы (по 5 особей в каждой): контрольные животные, кото-

рые получали инъекцию изотонического раствора NaCl (2 мл/кг) и 2 группы крыс, подвергнутых инте-роцептивному стрессу.

Интероцептивный стресс моделировали путем внутрибрюшинного введения Л ПС из E. Coli (Sigma, США) в дозе 5 мг/кг. Животных декапити-ровали через 7 и 24 ч, собирали кровь и извлекали мозг. Новую кору (префронтальную часть (ПФК) и фрагмент, включавший височную, париетальную и окципитальную части (К)) и гиппокамп (ГК) быстро выделяли на льду и замораживали при —70°С до проведения исследования. Животных не перфузи-ровали, так как ранее было показано, что перфузия не оказывает значительного влияния на индуцированный ЛПС уровень ИЛ-lß [8]. Кровь центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин и сыворотку отделяли для определения содержания ИЛ-lß.

Образцы ткани гомогенизировали (тефлон-стекло) в 25 мМ HEPES рН 7.4 (1 : 4), содержащим ингибиторы протеаз (pepstatin, leupeptin, aprotinin — по 10 мкг/мл, PMSF — 1 мМ) и небольшие количества ионных (ЭДТА, ЭГТА — по 1 мМ) и неионных (CHAPS - 0.1%) детергентов, а также MgCl2 (5 мМ). Гомогенат центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин при 4°С, супернатант отбирали для определения ИЛ-1 и белка (по Бредфорд). Осадок затем гомогенизировали в тризоле для последующего извлечения мРНК.

Уровень ИЛ-1 ß определяли неконкурентным иммуноферментым методом на основе антител фирмы Peprotech (США). С целью повысить чувствительность метода и снизить неспецифическое связывание с вторичными антителами рекомендованный производителем протокол модифицировали: время покрытия плашки первичным антителом и инкубации с антигеном было увеличено до 24 ч. Концентрация БСА для забивки участков неспецифического связывания была увеличена до 3%. Кроме того, был использован хемилюминесцентный субстрат вместо хромогенного.

Экспрессию Эпо определяли методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе BioRad MiniOp-ticon (США) с использованием наборов фирмы "Силекс" (Россия), содержащих краситель Cyber-Green. Уровень сигнала нормировали по экспрессии 18S рибосомальной субъединицы. Последовательности праймеров были подобраны с помощью программы SECentral. Для Эпо (5'-3') прямой: GCTCCAATCTTTGTGGCATCT обратный: TGGCTTCGTGACCCTCTGT для 18S мРНК (5'-3'), прямой: AGTCAGTTCATCCGGCCTCA, обратный: TGGGAACAGACCTGCTCGAT. Параметры реакции подбирали, исходя из физико-химических свойств праймеров. Специфичность продукта определяли по кривой плавления и дополнительно по длине продукта, выявляемой электрофорезом в агарозном геле с красителем.

60 г

50 -

св

Ч о 40

ю 40

^30 с

Ч//////А ПФК

I-1К

^^ГК

p < 0.05 *

са i

20 -

10 -

35 г

30 -

л 25 -

ъ

[-1 с 20 -

са 15 -

Й

И 10 -

контроль 7 ч б

24 ч

контроль

7 ч

24 ч

Рис. 1. а: уровень ИЛ-1Р в отделах мозга крыс после внутрибрюшинной инъекции ЛПС в дозе 5 мг/кг. б: уровень ИЛ-1Р в сыворотке крыс после интрапери-тонеальной инъекции ЛПС в дозе 5 мг/кг.

* — Отличие от контроля (критерий Манна—Уитни; р < 0.01); отрезками обозначены различия между временными точками 7 и 24 ч (критерий Манна—Уитни). ПФК — префронтальная часть новой коры; К — фрагмент новой коры, включающий височную, париетальную и окципитальную части; ГК — гиппокамп.

Статистическую обработку проводили в программе Statistica 8.0 с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни, а также вычисляли коэффициенты ранговой корреляции Спирма-на. Данные представлены в виде M ± SEM.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ранее было показано, что ЛПС, будучи введенным в дозах на три порядка меньше использованных нами, уже вызывает воспалительный ответ нервной ткани [8]. Таким образом, введением высокой дозы (5мг/кг) ЛПС мы моделировали мощный интроцептивный стресс. Действительно, мы наблюдали острый воспалительный ответ во всех изученных отделах мозга, а также в крови крыс через 7 ч после инъекции (рис. 1а). На этом этапе уровни провоспалительного ИЛ-lß и экспрессии Эпо были схожими в новой коре и в гиппокампе (рис. 1 и 2).

а

0

218

ПИСКУНОВ и др.

140 г

S 120 g

g 100 g

£ 80 -

и р

m «

S

§ 40 р

а

I 20

p < 0.05

У/////А ПФК

I-1К

^^ГК

60 -

контроль 7 ч

24 ч

Рис. 2. Экспрессия Эпо в отделах мозга крыс после интраперитонеальной инъекции ЛПС в дозе 5 мг/кг. Уровень экспрессии Эпо нормализован по экспрессии 188 субъединицы рибосомальной мРНК. Обозначения как на рис. 1.

Кроме того, были отмечены положительные корреляции между Эпо и ИЛ-1р (в отделах коры г = 0.9; р < 0.05; в гиппокампе г = 0.82;р < 0.09). Таким образом, вызванное интроцептивным стрессом нейро-воспаление на первом этапе, очевидно, имело адаптивный характер, и высвобождение ИЛ-1р компенсировалось появлением дополнительного ЭПО, как в структурах коры, так и в гиппокампе.

Через сутки после инъекции содержание ИЛ-1р в крови вернулось к исходным значениям (рис. 1а). В мозге экспрессия цитокина оставалась выраженной, однако наблюдались принципиальные различия между новой корой и гиппокампом (рис. 1 и 2). В отделах коры уровень провоспалительного цитокина снизился почти вдвое на фоне сохранения высокого уровня экспрессии Эпо. Сохранились также корреляции между Эпо и ИЛ-1р (г = 0.78—0.9; р < 0.1). В гиппокампе же, напротив, содержание ИЛ-1р оказалось значительно повышенным по сравнению с точкой 7 ч (45.3 ± 8.07 и 25.7 ± 2.99 пг/мг белка соответсвенно), в то время как экспрессия Эпо снизилась почти в два раза. С этими изменениями исчезла и положительная корреляция между этими параметрами. Продолжение накопления провоспа-лительного цитокина в гиппокампе на фоне снижения экспрессии протекторного фактора может указывать на дезадаптационный характер изменений в данной структуре (но не в коре) на этом этапе.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Системное введение ЛПС вызывает нейровос-паление [9], и в этом отношении наши результаты полностью согласуются с данными литературы. Бо-

лее того, ранее были отмечены определенные регионарные различия воспалительного ответа при введении ЛПС [8]. В данной работе впервые обнаружена различная динамика нейровоспаления в отделах новой коры и гиппокампе. Кроме того, мы более детально изучили характеристики воспалительного ответа. Эпо рассматривается как часть цитокин

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Медицина и здравоохранение»