МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 6, с. 1026-1035
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21
СЕМАКС И ЕГО С-КОНЦЕВОЙ ФРАГМЕНТ PGP ВЛИЯЮТ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ НЕЙРОТРОФИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ В УСЛОВИЯХ НЕПОЛНОЙ ГЛОБАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МОЗГА КРЫС
© 2011 г. В. В. Ставчанский1*, Т. В. Творогова2, А. Ю. Боцина2, В. И. Скворцова2, С. А. Лимборская1, 2, Н. Ф. Мясоедов1, Л. В. Дергунова1, 2
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182 2Научно-исследовательский институт цереброваскулярной патологии и инсульта Российского государственного медицинского университета, Москва 117997 Поступила в редакцию 20.12.2010 г. Принята к печати 11.03.2011 г.
Нейротрофины регулируют основные функции клеток нервной ткани, поэтому анализ экспрессии мРНК нейротрофинов необходим для оценки нейропротекторных свойств новых лекарственных средств, применяемых при ишемии головного мозга. Изучено влияние синтетического пептида семакс и его С-концевого фрагмента Pro-Gly-Pro на экспрессию генов нейротрофинов (Ngf Bdnf, Nt-3) и их рецепторов (TrkA, TrkB, TrkC и p75) в лобных долях, гиппокампе и мозжечке крыс спустя 30 мин, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч после необратимой окклюзии общих сонных артерий. Относительный уровень экспрессии мРНК нейротрофинов и их рецепторов оценивали методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Показано, что ишемия вызывает значительное снижение экспрессии генов в гиппокампе. Семакс и PGP воздействуют на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов преимущественно в лобной коре и гиппокампе ишемизированных животных. В лобной коре крыс под действием семакса уровень мРНК генов рецепторов нейротрофинов снижался, а под действием PGP — увеличивался. Максимальный нейропротекторный эффект пептидов проявился в гиппокампе животных спустя 12 ч после окклюзии сосудов, когда ишемическое повреждение привело к существенному снижению экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов. Применение обоих пептидов в этот момент времени компенсировало вызванные ишемией изменения в экспрессии генов. Полученные результаты приближают нас к пониманию механизма действия семакса, а также дают представление о некоторых особенностях экспрессии мРНК нейротрофинов и их рецепторов в условиях эксперимента.
Ключевые слова: BDNF, NGF, Nt-3, TkA, ТГкВ, ТГкС, p75, семакс, PGP, количественный метод ОТ-ПЦР, крысы Wistar, неполная глобальная ишемия мозга, экспрессия мРНК.
THE EFFECT OF SEMAX AND ITS C-END PEPTIDE PGP ON EXPRESSION OF THE NEUROTROPHIC AND THEIR RECEPTORS IN THE RAT BRAIN DURING INCOMPLETE GLOBAL ISCHEMIA, by V. V. Stavchansky1*, T. V. Tvorogova2, A. Y. Botsina2, V. I. Skvortsova2, S. A. Limborska1'2, N. F. Myasoedov1, L. V. Dergunova1' 2 ^Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 123182 Russia; *e-mail: bacbac@yandex.ru; 2Federal Stroke Institute, Russian State Medical University, Moscow, 117997 Russia). Neurotrophins regulate key function of nervous tissue cells. Analysis of neurotrophins mRNA expression is an appropriate tool to assess therapeutic efficiency of the anti-stroke drugs. We have analyzed the effect of synthetic peptide se-max and its C-terminal Pro-Gly-Pro tripeptide upon mRNAs expression of neurotrophins Ngf, Bdnf, Nt-3 and their receptors TrkA, TrkB, TrkC,p75in rat frontal lobes, hippocampus and cerebellum after bilateral common carotid artery occlusion. The animals were decapitated 30 min, 1, 2, 4, 8, 12, 24 h after the operation. The mRNA expression of neurotrophins and their receptors was assessed by relative quantification using real-time RT-PCR. Our results showed that ischemia causes a significant decrease in gene expression in the hippocampus. Semax and PGP treatment affected the expression of neurotrophins and their receptors predominantly in the frontal cortex and hippocampus of the ischemized animals. In the frontal cortex, Semax treatment resulted in a decrease of mRNA level of neurotrophin receptors, while PGP treatment increased the level of these mRNA. Maximal neuroprotective effect of both peptides has been observed in the hippocampus 12 h after occlusion. A decrease of gene expression of neurotrophins and their receptors caused by the occlusion was overcome by Semax and PGP. These results clarify the semax mechanism of action and present certain features of mRNA's expression of neurotrophins and their receptors in experimental conditions.
Keywords: BDNF, NGF, Nt-3, TrkA, TrkB, TrkC, p75, semax, PGP, real-time qRT-PCR, Wistar rat, incomplete global cerebral ischemia, mRNA expression.
Принятые сокращения: АКТГ — адренокортикотропный гормон; ПЦР — полимеразная цепная реакция; ОТ — обратная транскрипция; ОАОРН — глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа.
* Эл. почта: bacbac@yandex.ru
Нейротрофины — семейство белков, контролирующих такие важные процессы, как пролиферация, развитие и выживаемость нейронов, рост аксонов и обрыв дендритов, формирование и функционирование синапсов, а также экспрессию нейротрансмиттеров и белков ионных каналов. У млекопитающих обнаружены четыре нейро-трофина: фактор роста нервов (NGF), нейротрофи-ческий фактор головного мозга (BDNF), нейротрофины-3 и -4 (NT-3 и -4) [1, 2]. Свои функции нейротрофины реализуют через взаимодействие со своими рецепторами — трансмембранными тирозиновыми киназами (Trk). NGF преимущественно связывается с рецептором TrkA, BDNF и NT-4 — с TrkB, NT-3 — c TrkC. Каждый нейротро-фин также способен связываться с низкоаффинным рецептором p75 из семейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNF), что может влиять на функции рецептора Trk или на такие процессы, как апоптоз и ретроградный транспорт ней-ротрофинов [1, 2].
Нейротрофины играют важную роль в защите нервной ткани от ишемического повреждения [3—5], и поэтому они могут использоваться в качестве нейропротекторов в терапии инсульта. [6]. Однако более эффективным может быть применение лекарственных средств, способных модулировать активность различных компонентов системы нейротрофинов и их рецепторов [6]. В число препаратов, обладающих нейропротекторной активностью, входит отечественный препарат се-макс — синтетический пептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, аналог фрагмента АКТГ (4—7), к С-концу которого присоединен трипептид Pro-Gly-Pro (PGP). Ранее в опытах in vitro и in vivo было показано, что семакс влияет на содержание (экспрессию) нейротрофинов и их рецепторов, а также их мРНК [7—10]. Трипептид PGP, защищающий молекулу семакса от преждевременной деградации, также обладает регуляторной активностью. Нейропротекторные свойства PGP наблюдали в культурах нервных клеток в условиях окислительного стресса [11] и глутаматной токсичности [12].
Молекулярные механизмы, лежащие в основе нейропротекторного эффекта семакса, активно изучаются. К основным проявлениям нейропро-текторного действия семакса относят иммуномо-дуляцию, торможение воспалительных реакций, синтеза оксида азота и реакций окислительного стресса [13, 14]. Ранее нами было показано, что семакс усиливает пролиферативную активность нейроглии, эндотелия сосудов и прогениторных клеток в субвентрикулярной зоне нейрогенеза [15]. Особый интерес вызывает возможное влияние семакса на систему нейротрофинов и их рецепторов, так как было показано положительное влияние семакса на выживаемость нервных клеток [16].
На данный момент точно неизвестно как семакс действует на экспрессию нейротрофинов и их рецепторов в различных участках головного мозга в условиях глобального дефицита глюкозы и кислорода. Особенно важно знать динамику таких изменений, прежде всего, в первые часы ишемии (так называемый период терапевтического окна) и далее до 24 ч. Эта информация может быть использована для анализа фармакологического действия семакса и выбора правильной стратегии лечения.
В связи со сказанным мы решили оценить изменения в экспрессии мРНК нейротрофинов и их рецепторов, вызванные применением препарата семакс и пептида PGP, в головном мозге крыс в зависимости от продолжительности неполной глобальной ишемии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Модель неполной глобальной ишемии. Исследования выполнены на крысах-самцах (n = 84) линии Wistar двухмесячного возраста массой около 200 г, содержавшихся в условиях естественного освещения и свободного доступа к еде и воде. Необратимую двустороннюю окклюзию общих сонных артерий (модель "неполная глобальная ишемия мозга") проводили стандартно: под эфирным наркозом через срединный разрез мягких тканей передней поверхности шеи выделяли обе общие сонные артерии и одновременно перевязывали их шелковой лигатурой. Операция занимала не более 10 мин. Через 15 мин после лигирования крысам внутрибрюшинно вводили один из препаратов: се-макс, С-концевой фрагмент семакса Pro-Gly-Pro (PGP) или физиологический раствор. В качестве контроля использовали ложнооперированных крыс. Таких животных под наркозом подвергали аналогичной операции, но, выделив общие сонные артерии, разрезанные ткани ушивали без лигирова-ния сосудов. В качестве препарата им вводили физиологический раствор. Таким образом, все крысы были разделены на четыре группы: 1 — ложноопе-рированные животные с введенным физраствором; 2 — ишемизированные животные с введенным физраствором; 3 — ишемизированные животные, получавшие семакс; 4 — ишемизированные животные, получавшие PGP. Каждую группу, в свою очередь, разделили на временные подгруппы: животных выводили из эксперимента через 30 мин, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч после окклюзии. В каждой подгруппе было не менее трех животных. Дополнительно препараты вводили животным, не выведенным из эксперимента, через 1, 4 и 8 ч после наложения лигатур. Семакс применяли из расчета 10 мкг/100 г веса крысы; PGP — 3.75 мкг/100 г. Крыс декапитирова-ли под действием эфирного наркоза. Гиппокамп, лобные доли коры и мозжечок помещали в жидкий азот, а затем хранили при —70°С.
Таблица 1. Праймеры, использованные для анализа экспрессии генов
Праймер Нуклеотидная последовательность GenBank acc. no. Позиция нуклеотидов Длина ПЦР-продукта, п.н.
Bdnf (F) 5'-AGGCACTGGAACTCGCAATG-3' NM_ 012513 859-879 99
Bdnf (R) 5'-TGTCTATCCTTATGAACCGCC-3' 937-957
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.