МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 233-238
К 100-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ A.A. БАЕВА ОНКОГЕНОМИКА ^
УДК 577.2:616-006
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕПЕРТУАРА РАКОВЫХ АНТИГЕНОВ И АУТОАНТИГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА
© 2004 г. Е. П. Королева1, М. А. Лагарькова2, С. В. Хлгатян2, Ю. В. Шебзухов2, А. А. Мещеряков3, М. Р. Личиницер3, С. А. Недоспасов12, Д. В. Купраш1*
1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А Н Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899 3Всероссийский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва, 115478
Поступила в редакцию 25.09.2003 г.
По спектру аутоантигенов человека можно проследить течение различных патологических процессов в организме, таких, например, как аутоиммунные заболевания или развитие опухолей. Рассмотрен метод серологического анализа экспрессионных клонотек (SEREX), который применяется в настоящее время в нескольких лабораториях мира для поиска новых раковых антигенов человека -возможных диагностических маркеров или мишеней иммунотерапии рака. В настоящем обзоре обобщен также наш опыт по поиску антигенов некоторых видов солидных опухолей. Обсуждаются группы антигенов, выявляющиеся при такого рода исследованиях, причины иммуногенности аутоантигенов и перспективы их применения для диагностики и мониторинга рака.
Ключевые слова: аутоантигены, иммунодиагностика рака, экспрессионные клонотеки, кДНК.
Определение репертуара аутоантигенов может внести вклад в исследование механизмов различных патологических процессов, в том числе аутоиммунных заболеваний и опухолевых трансформаций. Антигены, видоизмененные в процессе опухолевой трансформации, могут служить маркерами для диагностики и мишенями для иммунотерапии заболевания.
Для поиска антигенов, узнаваемых Т-лимфо-цитами, требуется предварительное культивирование цитотоксических Т-клеток пациента [1]. Наиболее технологичный способ прямой идентификации белковых антигенов, распознаваемых В-клетками, базируется на серологическом анализе экспрессионных клонотек. Этот способ, названный ББКБХ, первоначально предложен для поиска опухолевых антигенов [2]. С помощью серологического анализа экспрессионных клонотек были найдены ранее неизвестные антигены меланомы, рака молочной железы, рака толстого кишечника, лимфомы Ходжкина, рака легкого, рака пищевода и других опухолей [2-5].
Ниже мы суммируем результаты работ, посвященных поиску опухолевых антигенов с помощью серологического анализа.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В НАШЕЙ РАБОТЕ
Сыворотки получали из Отделения комбинированных методов лечения Всероссийского онко-
* Эл. почта: kuprash@online.ru
логического научного центра и из Отделения проктологии 24-ой городской клинической больницы Москвы. Для приготовления экспрессионных клонотек использовали РНК из двух клеточных линий рака толстой кишки LoVo и SW-480, а также РНК из пула семенников здоровых индивидов. кДНК синтезировали и клонировали в экс-прессионном векторе ^-ZAP ("Stratagene", США) согласно инструкции производителя. Иммуно-скрининг проводили, как описано ранее [5, 6], а ал-логенный скрининг - с использованием методики SMARTA [9]. Фаговые кДНК-клоны конвертировали в плазмиды pBKCMV согласно инструкциям производителя ("Stratagene"). Последовательность очищенной плазмидной ДНК определяли с помощью метода секвенирования по Сэнгеру с флуоресцентными терминаторами на приборе ABI Prism automated DNA sequencer ("Perkin Elmer", США).
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ТЕХНОЛОГИИ SEREX К РАЗЛИЧНЫМ ВИДАМ РАКА И ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА
Метод SEREX заключается в том, что из образца опухоли готовится клонотека кДНК в экс-прессионном фаговом векторе. Рекомбинантные белки, экспрессирующиеся во время литической инфекции, переносят на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем инкубируют с аутологич-ной сывороткой, предварительно очищенной от
Таблица 1. Статистика результатов по серологическому скринингу различных опухолей
Количество Число позитивных Ранее
Клоно- Источник мРНК проскрини- Разных неохаракте- Сыворотка Разведение
тека рованных клонов генов ризованных сыворотки
клонов генов
1 Рак почки 300000 69 45 14 Аутологичная 1:200
2 Рак почки 150000 27 21 4 Аутологичная 1:200
3 Клеточная линия колоректального рака 8,№-480 200000 76 37 4 3 смешанных сыворотки больных коло-ректальным раком 1:300
4 ТББ*-1 150000 37 25 8 3 смешанных сыворотки больных коло-ректальным раком 1:300
5 Клеточная линия колоректального рака ЬоУо 200000 49 27 6 3 смешанных сыворотки больных коло-ректальным раком 1:300
6 ТББ-2 200000 48 35 13 3 смешанных сыворотки больных коло-ректальным раком 1:300
7 ТББ-3 100000 57 26 9 5 смешанных сывороток больных коло-ректальным раком 1:400
* Источник РНК - пул нормальных семенников.
антител на бактериальные и фаговые белки. Клоны, на которые обнаруживается иммунный ответ с высоким титром отбирают для дальнейшего анализа и скринируют индивидуально. Известно, что хирургический образец опухоли может содержать некоторое количество В-лим-фоцитов и плазматических клеток. В результате в клонотеке будет обнаруживаться большое количество экспрессирующихся иммуноглобулинов. Для того, чтобы отделить ложноположительные клоны, кодирующие иммуноглобулины, от продуктов экспрессии опухолевых клеток, требуются дополнительные стадии скрининга.
Другой способ избежать загрязнения клоноте-ки транскриптами из нормальной клеточной стромы - использовать РНК из клеточных линий. При помощи исходной методики ЗБЯБХ мы провели поиск антигенов, характерных для рака почки [6], молочной железы [7] и яичника. В случае рака толстой кишки приготовляли клонотеки из двух клеточных линий, которые скринировали, используя смесь сывороток нескольких больных. Кроме того, для специфического поиска раково-тестикулярных антигенов (т.е. антигенов, специфически синтезирующихся в клетках зародышевой линии и в опухолях) создали клонотеку из нормальных семенников. Ее дополнительно скринировали с использованием нескольких наборов сывороток больных раком толстой кишки, у которых ранее обнаруживался иммунный ответ на различные известные раковые антигены, в том числе р53 и КУ-ББО-!. Однако при скринин-
ге клонотеки из нормальной ткани может выявляться большое количество клонов, кодирующих аутоантигены неракового происхождения. Так, например, при скрининге клонотеки TES-3 из 57 позитивных клонов 16 кодировали белок ODF2 (Outer dense fiber of sperm tails 2) (Hs.129055), один из известных аутоантигенов спермы [8]. Некоторые результаты скринингов представлены в табл. 1.
Большинство клонов, полученных при первичном анализе клонотеки, отсеивается при последующем аллогенном скрининге, т.е. при скрининге с помощью представительных наборов из коллекции сывороток здоровых доноров и раковых больных. Лишь небольшая часть клонов, белковые продукты которых узнаются преимущественно сыворотками раковых больных, могут представлять интерес как потенциальные опухолевые маркеры или возможные мишени для противоопухолевых вакцин. Таким образом, алло-генный скрининг является одной из наиболее продолжительных и трудоемких стадий данного анализа. Поэтому нами была разработана процедура, названная SMARTA (Serological Mini-Arrays of Recombinant Tumor Antigens) [9], которая позволяет существенно облегчить и ускорить процедуру аллогенного скрининга за счет одновременного нанесения большого числа клонов на одну мембрану. Этот подход может служить также основой для создания диагностических панелей, несущих набор антигенов, на которые формируется иммунный ответ у разных групп пациентов.
Таблица 2. Примеры генов, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями, выявляющиеся при серологических скринингах сыворотками больных колоректальным раком
Клон Антиген Заболевание Частота встречаемости антител в сыворотках, % Ссылка
MO-TES-4 Тирозил-тРНК-синтетаза Ревматоидный артрит, сис- 2 [18]
темная красная волчанка
MO-TES-117 Спектрин а Синдром Шегрена 2 [19]
MO-TES-375 Филамин A Миастения гравис 1 [20]
M0-C0-80, Увеальный аутоантиген с Аутоиммунный увеит 15 [21]
M0-TES-217 анкириновыми повторами
Таблица 3. Ранее не описанные часто встречающиеся аутоантигены человека
Клон Антиген Частота встречаемости антител в сыворотках, % Ссылка
M0-TES-62 Якорный белок А-киназы 13 83 [22]
M0-TES-178 Рецептор антимюллеровского гормона, тип II 79 [23, 24]
MO-CO-1023 Глутамил-пролил-тРНК-синтетаза 33 [25]
M0-TES-357 Белок 15, ген которого содержит тринуклеотидный повтор 30 [26]
M0-C0-132 Адапторный белковый комплекс 3, субъединица 51 30 [27]
M0-TES-419 Якорный белок А-киназы 10 13 [28]
При серологическом скрининге обнаруживается несколько групп антигенов. Лишь небольшая доля клонов (от 1% до 2% в каждой клоноте-ке) имеет выраженный раковоспецифический профиль реактивности, другими словами, гуморальный ответ на эти антигены обнаруживается преимущественно у раковых больных. Около половины клонов, полученных при каждом скрининге, кодируют антигены, не имеющие раковой специфичности: иммунный ответ на них обнаруживается в сыворотках раковых больных и здоровых доноров. В этой группе можно обнаружить и известные антигены, ассоциированные с различными аутоиммунными состояниями (примеры таких клонов приведены в табл. 2), и белки, вызывающие иммунный ответ у многих доноров, причина иммуногенности которых до сих пор не ясна (табл. 3). Иммунный ответ на оставшиеся клоны обнаруживается только в сыворотке, которую использовали для первичного скрининга. Это может свидетельствовать либо о том, что это индивидуальные аутоантигены, либо о том, что это редко встречающиеся раковые антигены. Гуморальный ответ на антиген, обнаруженный при исследовании какого-либо определенного вида рака, может также обнаруживаться у больных с опухолями другой этиологии. Частота встречаемости антител на данный антиген при этом варьирует в группах больных с различными злокачественными опухолями, однако редко превышает 10-15%. В сыворотках разных паци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.