НЕИРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 1-2, с. 138-145
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.816.7:[661.249]
СЕРОВОДОРОД КАК ЭНДОГЕННЫЙ МОДУЛЯТОР ОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА В НЕРВНО-МЫШЕЧНОМ СИНАПСЕ ЛЯГУШКИ
© 2008 г. Е. В. Герасимова1*, Г. Ф. Ситдикова1, А. Л. Зефиров2
1 Казанский государственный университет 2 Казанский государственный медицинский университет
В опытах на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки с использованием внеклеточного и внутриклеточного микроэлектродного отведения синаптических сигналов исследовали влияние газообразного сероводорода (H2S) и его донора гидросульфида натрия (NaHS) на параметры функционирования нервно-мышечного синапса. Показано, что экзогенный H2S увеличивает частоту спонтанных и амплитуду вызванных постсинаптических сигналов, не влияя на электро-генез двигательного нервного окончания и распределение синаптических задержек. Увеличение постсинаптических сигналов было связано с повышением квантового состава. В условиях ритмического раздражения двигательного нерва (10 и 50 имп/с) на фоне действия NaHS наблюдалось менее выраженное облегчение освобождения медиатора по отношению к контролю, что связано с увеличением исходного уровня секреции, при этом динамика выходящих калиевых токов нервного окончания не менялась. Субстрат синтеза H2S - L-цистеин приводил к увеличению вызванного освобождения медиатора, тогда как блокаторы ферментов синтеза H2S, аминооксиацетиловая кислота и в-цианоаланин, к снижению. Сделано заключение, что сероводород может синтезироваться в области нервно-мышечного синапса и является эндогенным модулятором освобождения ацетилхолина, влияя на молекулярные механизмы экзоцитоза синаптических везикул.
Ключевые слова: сероводород, fí-цианоаланин, аминооксиацетиловая кислота, цистеин, нервно-мышечный синапс, секреция медиатора.
Принятые сокращения: H2S - сероводород, NaHS- гидросульфид натрия, НО - нервное окончание, ТКП - токи концевой пластинки, ПКП -потенциалы концевой пластинки, МПКП - миниатюрные потенциалы концевой пластинки, [Ca2+]0 - внеклеточная концентрация ионов кальция, [Mg2+]0 - внеклеточная концентрация ионов магния, NO - оксид азота (II), CO - монооксид углерода, К(Са) - кальций-активируемые калиевые, CBS -цистатионин ß-синтаза, CSE - цистати-онин у-лиаза, АОАК - аминооксиацетиловая кислота.
Сероводород (H2S) - газ, обладающий хорошо известными токсическими эффектами, связанными с нарушением окислительного фосфорилиро-вания в клетке [1]. В тканях млекопитающих обнаружены высокие концентрации H2S: в плазме крови крыс содержание H2S составляет 46 мкМ, в тканях мозга 50-100 мкМ [2, 3]. При некоторых нейродегенеративных процессах и сердечно-сосудистых заболеваниях наблюдается изменения уровня H2S в тканях [4]. У водных позвоночных в гладкой мускулатуре концентрации H2S достига-
* Адресат для корреспонденции: 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18, e-mail: levchenkova_elena@rambler.ru
ют 300 мкМ [5]. Эти данные позволяют предполагать физиологическую роль этого газа. Ряд исследователей относят H2S к особой группе газообразных посредников наряду с оксидом азота (II) (NO) и монооксидом углерода (СО) [4, 6, 7]. Так же как NO и CO, H2S участвует в расслаблении гладкой мускулатуры у млекопитающих [3, 8], физиологические концентрации этого газа усиливают активность НМДА рецепторов и облегчают индукцию долговременной потенциации в гиппо-кампе [2]. Показано, что H2S приводит к увеличению внутриклеточного кальция в астроцитах и вызывает кальциевые волны, опосредуя взаимодействие между нейронами и глией [9]. Известными мишенями H2S являются аденилатциклаза [10] и АТФ-зависимые К-каналы [3, 4]. Эндогенно H2S синтезируется из L-цистеина пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин ß-синтазой (CBS) и цистатионин у-лиазой (CSE), которые экспрессируются практически во всех тканях [11]. Показано, что эндогенный синтез сероводорода в нервной системе вызывается кратковременной активацией CBS вследствие нейро-нального возбуждения и входа кальция [12].
Целью работы являлось изучение влияния сероводорода на ионные токи двигательного нерв-
ного окончания и секрецию медиатора, и выявление возможности его эндогенного синтеза в области нервно-мышечного синапса лягушки.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы озерной лягушки в осенне-зимний период. Все эксперименты выполнены в условиях постоянной перфузии препарата раствором Рингера следующего состава (в мМ): NaCl - 115; KCl - 2.5; CaCl2 - 1.8; HEPES - 5 (t = 20 ± 0.5°C, рН 7.2-7.4). Для устранения сокращения мышц в раствор добавляли d-тубокурарин в концентрации 30 мкМ или использовали раствор Рингера с пониженной концентрацией ионов кальция ([Ca2+]0 ) (0.2-0.4 мМ) и повышенной концентрацией ионов магния ([Mg2+]0) (2-4 мМ).
В экспериментах использовали гидросульфид натрия (NaHS), 4-аминопиридин, d-тубокурарин, L-цистеин, аминооксиацетиловую кислоту (АО-АК), Р-цианоаланин ф-ЦА) (все вещества фирмы Sigma, США). Газообразный H2S получали в реакции: Na2S + 2HCl = 2NaCl + H2S, которую проводили в вытяжном шкафу [13]. В двугорлую колбу помещали Na2S и медленно по каплям добавляли 20%-ную HCl, вращая колбу для равномерного перемешивания. Образовавшимся в результате реакции H2S насыщали 20 мл раствора Рингера в течение 30 мин непосредственно перед экспериментом. С учетом растворимости H2S концентрация базового раствора составляла 98 мМ [14]. Данный раствор сразу же доводили до необходимой концентрации H2S и добавляли в систему перфузии. NaHS широко используется в научных исследованиях в качестве донора H2S [2], так как в водных растворах диссоциирует до иона натрия (Na+) и гидросульфидного аниона (HS), который реагирует с протоном (H+), образуя H2S. Известно, что в физиологическом растворе одна треть H2S находится в недиссоциированной форме, а остальные две трети существуют в виде HS- [2].
Двигательный нерв кожно-грудинной мышцы раздражали одиночными электрическими стимулами с частотой 0.2 имп/с или пачками ритмических стимулов (500 раздражений) с частотой 10 или 50 имп/с.
При внеклеточном отведении микроэлектрод, заполненный раствором NaCl (2M), подводили к проксимальному участку нервной терминали. В ответ на раздражение двигательного нерва регистрировали трехфазный ответ нервного окончания (НО) и токи концевой пластинки (ТКП) (рис. 1А). Известно, что первая (положительная) фаза регистрируемого ответа отражает выходящий пассивный ток, генерируемый распространяющимся потенциалом действия, вторая (отрица-
тельная) фаза отражает входящие Ка+-токи, а третья (положительная) - выходящие К+-токи через потенциалзависимые и кальций-активируе-мые (К(Са)) К-каналы. В условиях низкой [Са2+]0 третья фаза ответа НО отражает, в основном потенциалзависимые К+-токи [15]. Ответы НО и ТКП усреднялись по 30 реализациям (при одиночном раздражении) и по 100 реализациям (при ритмическом раздражении). Проводили анализ амплитуды и квантового состава ТКП, параметров второй и третьей фазы ответа НО. Квантовый состав рассчитывался по методу выпадений [16]. Для определения синаптической задержки подсчитывали временной интервал между пиком второй фазы ответа НО и началом одноквантово-го ТКП (на уровне 20% его амплитуды).
При внутриклеточном отведении микроэлектрод, заполненный раствором КС1 (2 мМ), вводили в мышечное волокно в области синапса. Регистрировали вызванные потенциалы концевой пластинки (ПКП) и спонтанные (миниатюрные) ПКП (МПКП). Анализировали амплитуду, время нарастания и время полуспада ПКП и МПКП, а также частоту МПКП.
Анализ и обработку регистрируемых сигналов производили с использованием автоматизированной системы, созданной на базе АЦП Ь-САЯБ-1250 и персонального компьютера. Для статистической обработки полученных данных использовали параметрический ^критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние газообразного И2Б и NaHS на амплитуду постсинаптических сигналов и электроге-нез двигательного НО (внеклеточное отведение). При внеклеточном отведении добавление газообразного И2Б (500 мкМ) в перфузируемый раствор с низкой [Са2+]0 (0.2-0.4 мМ) приводило к быстрому и обратимому увеличению амплитуды ТКП, которая к 15 мин эксперимента увеличилась относительно контроля до 216 ± 29% (рис. 1А). Увеличение амплитуды сопровождалось ростом квантового состава ТКП до 320 ± 42% (п = 5; р < 0.05) (рис. 1В). Донор сероводорода КаШ в концентрации 500 мкМ к 15 мин эксперимента также обратимо повышал амплитуду и квантовый состав ТКП до 225 ± 21% (рис. 1Б) и 288 ± ± 31% (п = 5; р < 0.05) (рис 1В) соответственно. Идентичность эффектов И2Б и КаИБ позволила нам в дальнейших экспериментах использовать КаИБ в качестве донора сероводорода. На рис. 1Г представлена кривая дозозависимости эффектов КаИБ на квантовый состав ТКП, ЕС50 = 72 ± ± 31 мкМ.
В условиях пониженной внеклеточной концентрации ионов Са, как газообразный И2Б, так и КаИБ не вызывал изменения амплитудно-времен-
Ответ НО
A
\
TKn
Koнтpoль
Б
Koнтpoль
H2S
NaHS
2 мс
Хвантовый состав TKH, % 4OO В
З00-
2OO
lOO
Kвaнтoвый состав TKH, %
З50г
З00-
250 2OO l5O lOO
H2S NaHS
40 мин
10 100 1000 Koнцeнтpaция NaHS, мкM
Рис. 1. Влияние газообразного H2S и NaHS на вызванную секрецию медиатора.
А - усредненные ответы нервного окончания и следующие за ними ТКП (30 реализаций) в контроле и при действии H2S (500 мкМ) (отдельный эксперимент).
Б - усредненные ответы нервного окончания и следующие за ними ТКП (30 реализаций) в контроле и при действии NaHS (500 мкМ) (отдельный эксперимент).
В - динамика изменения квантового состава ТКП на фоне действия H2S (500 мкМ) и NaHS (500 мкМ) при одиночной
стимуляции.
▼ - H2S, А - NaHS.
Г - кривая дозозависимости эффектов NaHS на квантовый состав ТКП. ([Ca2+]0 = 0.2-0.4 мМ, [Mg2+]o = 2-4 мМ).
ных параметров ответа НО, что позволяет предположить отсутствие эффектов Н2Б на потенци-алзависимые и К+-токи. Для выявления влияния Н2Б на К(Са)-токи использовали раствор Рингера с нормальной [Са2+]0 (1.8 мМ), в который добавляли блокатор потенциалзависимых К-ка-налов 4-аминопиридин (100 мкМ).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.