ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 707-713
УДК 581.148:577.42
СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА И СОДЕРЖАНИЯ ДЕГИДРИНОВ
В РАСТЕНИЯХ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
© 2004 г. И. В. Ступникова, Г. Б. Боровский, В. К. Войников
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск
Поступила в редакцию 15.03.2004 г.
С помощью одномерного ДДС-№-электрофореза в ПААГ и иммунохимических методов изучали сезонные изменения спектрального состава и содержания дегидринов в растениях озимой пшеницы вида ТгШеит aestivum Ь., выращенных в полевых и лабораторных условиях. В период закаливания растения накапливали дегидриноподобные полипептиды с мол. м. 209, 196, 66, 50 и 41 кД. С наступлением зимы появлялись и накапливались низкомолекулярные дегидрины с мол. м. 24, 22, 17, 15 и 12 кД, содержание которых значительно снижалось весной, при переходе растений в незакаленное состояние. Накопление/снижение содержания этих белков перед уходом в зиму и в зимне-весенний период соответствовало сезонным флуктуациям криотолерантности зимующих растений. Предполагается, что высоко- и среднемолекулярные дегидрины принимают участие как в стресс-реакции, так и в адаптации растений, тогда как низкомолекулярные, по-видимому, участвуют только в процессах низкотемпературной адаптации.
Triticum aestivum - закаливание - дегидрины - стрессовые термостабильные белки - Сог-полипеп-тиды
Озимые растения в течение вегетации, особенно в период подготовки к зиме или во время перезимовки, подвергаются различным повреждающим воздействиям среды. Общим элементом многих из них является клеточная дегидратация [1]. Так, ограничение поступления влаги в растения в результате замерзания почвы и угнетающего влияния холода на поглотительные процессы совместно с внутриклеточным образованием льда, и нагреванием листовой поверхности под действием солнца приводят к быстрому снижению содержания воды в растениях [2].
Осеннее закаливание, которое сопровождается не только постепенной дегидратацией, но и накоплением АБК, а также ультраструктурными перестройками клеток, приводит к увеличению криотолерантности растений и способствует их успешной перезимовке [3, 4]. Все эти процессы регулируются, главным образом, на уровне экспрессии генов, кодирующих стрессовые белки или Cor (регулируемые холодом)-полипептиды.
Сокращение: Cor - регулируемые холодом (от cold regulated). Адрес для корреспонденции: Ступникова Ирина Владимировна. 664033 Иркутск, а/я 1243. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: 7 (3952) 51-07-54; электронная почта: irina@sifibr.irk.ru
Многие из них относятся к суперсемейству LEA (Late Embryogenesis Abundant), из которых наиболее изученным является семейство дегидринов [5]. Белки этого семейства отличаются наличием высококонсервативных Y, S и K-сегментов, а также последовательностей, богатых глицином [6]. Благодаря высокому содержанию гидрофильных и заряженных аминокислот дегидрины стабильны при кипячении. Предполагается, что они увеличивают способность клетки выдерживать экстремальные pH и осмотический стресс, способствуют сольватации и защите других макромолекул и клеточных структур в период дегидратации [6, 7].
Отмечена корреляция между эндогенной концентрацией этих полипептидов в растениях и устойчивостью вида, органа или ткани [8, 9]. Картина накопления дегидринов у древесных растений совпадала с сезонными флуктуациями их холодоустойчивости [10, 11]. Однако особенности сезонных изменений в качественном составе и содержании этих белков в зимующих травянистых растениях не изучены. Мы предположили, что качественный состав и содержание дегидринов в осенний подготовительный период, зимой и весной изменяются в зависимости от криотолерантности зимующих растений.
707
5*
Целью настоящей работы явилось выявление возможных закономерностей в сезонных изменениях качественного состава и содержания дегид-ринов в растениях озимой пшеницы.
МЕТОДИКА
В работе использованы 12-дневные этиолированные проростки и узлы кущения озимой пшеницы (Triticum aestivum L., разновидность albidum) сорта Заларинка. Этот генотип является зимостойким и продуктивным в условиях лесостепной зоны Восточной Сибири [12].
Проростки выращивали в лабораторных условиях на влажной фильтровальной бумаге в термостате при 22°С в течение 3 сут, а затем закаливали в темноте при 4°С в течение 9 сут. В конце 9-х суток надземную часть срезали и использовали для изучения спектра термостабильных белков и для иммуноблоттинга.
Полевой опыт закладывали 25 августа. Узлы кущения собирали с 1 ноября по 4 мая через каждые 15 сут осенью и весной и раз в месяц зимой. Растения озимой пшеницы уходили в зиму в фазе кущения с 1-2 развитыми стеблями. Продолжительность их осенней вегетации составила 58 сут.
Раззакаливающий эффект повышенных температур изучали в лабораторных условиях на растениях, выращенных в вегетационных сосудах в поле. Вегетационные сосуды переносили в помещение с температурой 20°С 2 ноября. Пробы брали в первые, вторые и третьи сутки последующего роста.
По среднемноголетним данным зимний сезон (период года с отрицательной среднесуточной температурой воздуха) в районе исследований наступает в середине октября [13]. Весенний сезон начинается с середины апреля, когда среднесуточная температура воздуха поднимается выше 0°С [13]. В начале мая возобновляется рост растений. В районе исследований самый холодный месяц - январь со средней температурой от -21 до -28°С. В год исследований после схода снега в конце марта-начале апреля наблюдались значительные колебания среднесуточных температур воздуха от 12 до -17°С. В это время амплитуда колебания температур на поверхности почвы в отдельные дни достигала 40°С.
Водорастворимый белок выделяли из срезанных побегов и узлов кущения озимой пшеницы по описанной нами ранее методике [14]. Концентрацию белка определяли по методу Esen [15]. При электрофорезе на треки наносили равные количества белка (15 мкг). Электрофорез проводили в 10 и 13%-ном ПААГ с ДДС-Na в модифицированной системе Laemmli [16]. Белки окрашивали Ку-масси R-250 ("Sigma", США). Определение мол. м. полипептидов проводили, используя в качестве
стандартов набор белков с мол. м. 205, 116, 97, 66, 45 и 29 кД ("Sigma").
Иммуноблоттинг проводили по методике [17]. Антитела на дегидрины были любезно предоставлены проф. T.J. Close (США, Калифорнийский университет). Для выявления дегидринопо-добных белков использовали антитела на К-сег-мент, общий для растительных дегидринов, синтез которых индуцируется холодом и дегидратацией.
Гели и мембраны сканировали и анализировали при помощи программы "Sigma Scan Pro". Относительное содержание белков выражали в баллах.
Эксперименты проводили в трехкратной биологической повторности.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При помощи иммунохимических методов было установлено, что обнаруженные нами ранее термостабильные полипептиды с мол. м. 209, 196, 66, 50 и 41 кД, характерные для закаленного состояния озимой пшеницы [14, 18], родственны де-гидринам. Результаты иммуноблоттинга свидетельствуют о присутствии этих дегидриноподоб-ных белков как в закаленных проростках, так и в узлах кущения растений, прошедших низкотемпературную адаптацию в полевых условиях (рис. 1). Кроме того, в контрольных и закаленных проростках обнаружены низкомолекулярные дегидрины с мол. м. 46, 29 и 21 кД, содержание которых снижалось в период закаливания (рис. 1а).
На протяжении всего осенне-зимнего периода вплоть до апреля, т.е. до конца зимы в регионе исследований, качественный состав средне- и высокомолекулярных дегидриноподобных белков в узлах кущения не менялся (рис. 2, рис. 3). В то же время в содержании этих полипептидов в этот период были зарегистрированы заметные изменения (рис. 2). Так, в ходе осенней адаптации растений (октябрь) происходило накопление среднемо-лекулярных дегидринов, причем накопление белка с мол. м. 41 кД отмечено только на иммуно-химически окрашенных мембранах (рис. 2). Интересно, что при закаливании к холоду у растений озимой пшеницы, выращенных как в полевых, так и в лабораторных условиях, в наибольшей степени возрастало содержание дегидринов с мол. м. 50 и 66 кД. Увеличение количества сред-немолекулярных дегидринов в растениях озимой пшеницы наблюдалось с начальной стадии развития и продолжалось при значительном снижении среднесуточной температуры (рис. 1, 2). К началу ноября содержание этих термостабильных полипептидов достигало максимального уровня (рис. 2) и далее не изменялось вплоть до начала апреля (рис. 3).
Рис. 1. Дегидриноподобные белки, накапливающиеся в проростках, закаленных в лабораторных условиях (а), и узлах кущения растений, прошедших осеннее закаливание в поле (б).
а - иммуноблоты термостабильных белков, выделенных из контрольных (22°С, 4 сут, 1) и закаленных (4°С, 9 сут, 2) проростков; б - иммуноблот термостабильных белков, выделенных из узлов кущения растений, прошедших закаливание в поле. Образцы собраны 15 октября. Полипептиды фракционированы электрофорезом в 10%-ном ПААГ с ДДС-№, перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и инкубированы в растворе первичных антител на дегидрины (1 : 1000). Справа указаны молекулярные массы дегидринов.
С наступлением (середина октября) и в течение зимы, помимо отмеченной группы белков постепенно появлялись и накапливались низкомолекулярные дегидрины с мол. м. 24, 22, 17, 15 и 12 кД (рис. 2, рис. 3). Интересно, что на электро-фореграммах с термостабильными белками, выделенными из узлов кущения и окрашенными Ку-масси (рис. 2а), изменений в содержании низкомолекулярных белковых фракций в процессе закаливания растений не обнаружено.
Весной, в период возобновления роста (начало мая), содержание дегидринов заметно снижалось (рис. 3, май). Эти образцы были собраны после значительного повышения среднесуточных температур воздуха и стаивания снега. Чтобы проверить, влияет ли повышение температуры среды на наличие термостабильных дегидринов в растениях озимой пшеницы, вегетационные сосуды с растениями, выращенными в поле, были перенесены 2 ноября в помещение с температурой воздуха 20°
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.