БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 3, с. 217-220
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.112
ШАПЕРОННАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО
БЕЛКА Yersinia pseudotuberculosis
© 2015 г. Е. В. Сидорин*, О. В. Сидорова, Н. М. Тищенко, В. А. Хоменко,
О. Д. Новикова, Т. Ф. Соловьева
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159; *электронная почта: sev1972@mail.ru Поступило в редакцию 12.12.2014 г.
Ключевые слова: шаперон Skp, Yersinia pseudotuberculosis, белки наружной мембраны, белок-белковые взаимодействия, динамическое рассеяние света.
DOI: 10.7868/S0233475515030081
Клеточные белки могут выполнять свои биологические функции только обладая "правильной" трехмерной структурой. Вся необходимая информация о пространственной структуре белка заключена в его аминокислотной последовательности, и при определенных условиях она достаточна для сворачивания белка в нативную кон-формацию in vitro. Однако in vivo внутри клетки, где белок находится в более сложном окружении, этот процесс требует участия специальных клеточных факторов белковой природы, названных молекулярными шаперонами. Шапероны выполняют различные функции: они могут сопровождать вновь синтезированный белок к месту его локализации в клетке, поддерживая в развернутом, активном для транслокации состоянии; помогать сворачиванию и препятствовать агрегации развернутого белка; предотвращать летальную для клетки неспецифическую ассоциацию белков в стрессовых условиях [1—3].
Один из наиболее важных периплазматиче-ских шаперонов грамотрицательных бактерий — белок Skp (Seventeen kilodalton protein), участвующий в биогенезе белков наружной мембраны (БНМ). Белок Skp избирательно связывает несвернутые БНМ, когда они после транслокации через плазматическую мембрану перемещаются в периплазму, и образует с ними растворимые комплексы [4—6]. Таким образом, Skp функционирует как шаперон, который препятствует агрегации развернутого гидрофобного белка в водном окружении в периплазме.
Ранее нами из клеток Yersinia pseudotuberculosis был выделен и охарактеризован иммуноглобу-линсвязывающий белок (ИСБ), который неиммунным способом через Fc-фрагмент взаимодействует с IgG кролика и человека (подобно белку А
бактерии Staphylococcus aureus) [7]. Такие белки способны защитить бактериальную клетку от воздействия иммунной системы хозяина, уменьшая опсонизацию и фагоцитоз бактерий и действие комплемента. С помощью трипсинолиза, ВП-МАЛДИ-МС (масс-спектрометрии с матрич-но-активированной лазерной десорбцией/ионизацией и времяпролетным анализатором) и биоинформатики ИСБ был идентифицирован как белок-шаперон Skp Y. pseudotuberculosis (Swiss-Prot, P31520 и Q667J8) [7]. Зрелый Skp состоит из 143 аминокислотных остатков и имеет расчетную молекулярную массу 16.1 кДа. В результате множественного выравнивания аминокислотных последовательностей обнаружено высокое сходство первичных структур Skp энтеробактерий Y. pseudotuberculosis и Escherichia coli (степень идентичности 63— 69%, подобие аминокислотного состава 76—77%). В представленной работе изучали возможные ша-перонные свойства Skp Y. pseudotuberculosis , т.е. способность связывать развернутые БНМ и защищать их от агрегации.
C этой целью Skp Y. pseudotuberculosis экспрес-сировали в E. coli, рекомбинантный белок (rSkp) выделяли из клеток и очищали как описано нами ранее [8]. В качестве БНМ использовали порооб-разующий белок (порин) OmpF и фосфолипазу А (PldA) из наружной мембраны Y. pseudotuberculosis. Эти белки были получены в рекомбинантной форме в виде телец включения (ТВ) в клетках E. coli как описано ранее [9, 10]. Шаперонную активность полученного rSkp Y. pseudotuberculosis изучали с использованием Вестерн-блотинга и динамического рассеяния света (ДРС) с помощью прибора ZetaSizer Nano ZS ("Malvern", Великобритания). Для проведения Вестерн-блотин-га БНМ нами был получен коньюгат rSkp с перок-
Гидродинамический радиус, нм Гидродинамический радиус, нм
Шаперонная активность белка rSkp Y. pseudotuberculosis.
А — Электрофореграмма белков rOmpF и rPldA в составе ТВ в градиентном 10—25% SDS-ПААГ (а) и Вестерн-блот тех же образцов, выявленных с помощью rSkp, конъюгированного с пероксидазой хрена (б). 1 — ТВ, содержащие rOmpF; 2 — белки-маркеры с молекулярными массами 10, 15, 25, 35, 40, 55, 70, 100, 130 и 170 кДа; 3 — ТВ, содержащие rPldA. Б — Распределение по гидродинамическим радиусам частиц rSkp Y. pseudotuberculosis в растворе при pH 5.0 (сплошная линия) и 7.5 (прерывистая линия).
В — Распределение по гидродинамическим радиусам частиц rOmpF Y. pseudotuberculosis, образованных после разбавления раствора белка в 8 М мочевине в 10 раз 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5, в первый час (сплошная линия) и после 24 ч (прерывистая линия).
Г — Распределение по гидродинамическим радиусам частиц, образованных после разбавления раствора rOmpF в 8 М мочевине в 10 раз 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5, содержащим rSkp, в первый час (сплошная линия) и после 48 ч (прерывистая линия).
сидазой хрена согласно [11]. ТВ, содержащие rOmpF и rPldA, выделяли и растворяли в 8 М мочевине. Полученные смеси белков, в которых преобладали rOmpF и rPldA, разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na (SDS) (рисунок А, а), переносили на нитроцеллюлозную мембрану и обрабатывали меченым rSkp, который выявляли с помощью субстрата, содержащего 0.03% H2O2 и 0.05% диаминобензидина в буфере А (50 мМ прис-HCl, pH 7.5) (рисунок А, б). В результате было показано, что rSkp способен связываться с рекомбинантными БНМ Y. pseudotuberculosis, порином OmpF и фосфолипазой А, которые находятся в развернутой конформации.
В качестве модели БНМ для дальнейшего изучения шаперонных свойств rSkp был выбран rOmpF Y. pseudotuberculosis. Для выделения его в индивидуальном виде в развернутой форме ТВ, растворенные в буфере Б (50 мМ трис-НО, pH 7.5, 8 М мочевина) наносили на колонку Source 15Q, уравновешенную этим же буфером. После нанесения образца ТВ колонку промывали буфером Б для удаления слабо связанных белков. Десорбцию белков с колонки проводили с использованием элюции непрерывным градиентом NaCl (0.1—1 М) и изократического элюирования 2 М NaCl в буфере Б. Фракции, содержащие ре-комбинантные белки, объединяли в соответствии с результатами электрофореза в SDS-ПААГ и
ШАПЕРОННАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА 219
концентрировали с помощью ультрафильтрации на мембранах с пределом эксклюзии 1000 Да ("Рипор", Латвия). Объединенную фракцию повторно хроматографировали на колонке Source 15Q при вышеописанных условиях. После хроматографии и концентрирования фракции, содержавшие rOmpF, дополнительно очищали с помощью жидкостной хроматографии среднего давления на FPLC-хроматографе (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) на колонке Superdex 200 HR 10/300 GL в буфере Б.
Согласно опубликованным данным наиболее изученный на сегодня периплазматический ша-перон Skp E. coli в растворе представляет собой гомотример (Skp3), стабильный в широком диапазоне значений pH среды (от 3 до 11) [12]. Белок rSkp Y. pseudotuberculosis в буфере В (50 мМ CH3COONa/CH3COOH, рН 5.0) имеет вторичную структуру, подобную структуре Skp E. coli, и также существует в виде гомотримера [8]. Он может длительное время храниться в буфере с низкими значениями рН, сохраняя иммуноглобу-линсвязывающую активность, но достаточно быстро (в течение недели) агрегирует и выпадает в осадок при основных и нейтральных значениях pH. Для определения размера частиц, образуемых белком в растворах, мы использовали метод ДРС. Гидродинамический радиус (RH) частиц был рассчитан с помощью программного обеспечения к прибору. Как установлено, rSkp3 Y. pseudotubercu-losis в буфере В имеет частицы с гидродинамическим радиусом (RH), равным 4.2 ± 0.5 нм (рисунок Б), что хорошо согласуется с данными, приведенными для Skp3 E. coli (3.5 нм) [12]. Однако, если RH Skp3 E. coli не изменяется в широком диапазоне значений pH среды (от 3 до 11), то rSkp3 Y. pseudotuberculosis при переводе из ацетатного буфера в буфер А сразу же образует частицы с широким распределением по размеру и средним RH около 100 нм (рисунок Б). В течение последующих 5 ч скорость счета частиц rSkp3 Y. pseudotuberculosis уменьшалась на 40%, что свидетельствует об агрегации белка и образовании крупных седи-ментирующих частиц. Таким образом, при изменении значений рН буфера от кислых к щелочным в направлении к изоэлектрической точке белка (pI = 9.33) происходит его агрегация.
Реакцию связывания rSkp с rOmpF проводили в буфере А (рН 7.5), поскольку шаперонную активность белков изучают in vitro, в основном, при физиологических значениях рН в нейтральных или слабо щелочных буферах [12—15]. Белок rSkp переводили из буфера В в буфер А с помощью гель-фильтрации на колонке HiTrap Desalting (Amersham Biociences, Швеция) непосредственно перед реакцией с rOmpF. Аликвоту денатурированного rOmpF в буфере Б разбавляли в 10 раз буфером А как содержащим, так и не содержащим
rSkp. Молярное соотношение rOmpF : rSkp в смеси составило 1 : 3 (расчет на субъединицу белка), исходные концентрации белков определяли по УФ-спектрам в максимуме поглощения при 280 нм (молярные коэффициенты экстинкции равны 1.27 и 0.18 для rOmpF и rSkp соответственно). Размер образующихся частиц методом ДРС определяли с момента смешения образцов до 48 ч, в течение первого дня измерения выполняли через каждые 30 мин. При разбавлении образца rOmpF буфером А (рН 7.5) происходит резкое снижение концентрации мочевины (до 0.8 М), поддерживающей денатурированный белок в растворимой форме, что приводит к образованию крупных частиц с широким распределением их RH по размерам (от 8 до 5000 нм) (рисунок В). С течением времени rOmpF образует крупные седиментирую-щие частицы, выпадающие в осадок. В случае разбавления образца rOmpF в аналогичных условиях буфером, содержащим rSkp, в первые 1.5 ч наблюдается распределение частиц по размеру подобно описанному выше (без rSkp). Однако с увеличением времени реакции связывания это полимодальн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.