НЕИРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 3, с. 197-205
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.152.52
ШАПЕРОНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА ИММУНОСУПРЕССОРА FK506 - ИММУНОФИЛИНА FKBP12
ИЗ МОЗГА БЫКА
© 2007 г. Е. М. Лштова, A. C. Казаков, Б. Я. Гурвиц*
Институт биохимии им. АН. Баха РАН
Изучали шапероноподобные свойства цитоплазматического рецептора иммуносупрессора FK506 -иммунофилина FKBP12, выделенного из мозга быка, в тест-системе in vitro, основанной на торможении агрегации инсулина, индуцированной восстановлением дисульфидных связей под действием дитиотреитола и диссоциацией А- и В-цепей. С использованием метода динамического светорассеяния показано концентрационно-зависимое торможение интенсивности светорассеяния и уменьшение размеров (величины гидродинамического радиуса) аморфных агрегатов инсулина при внесении в инкубационную смесь FKBP12. Значительный эффект наблюдался в субстехиометрическом диапазоне концентраций FKBP12. Полученные результаты свидетельствуют о том, что FKBP12 обладает шапероноподобной активностью, проявляющейся в защите инсулина от агрегации.
Ключевые слова: агрегация белков, шапероны, инсулин, нейродегенерация, иммунофилин, мозг.
Большой интерес к изучению механизмов действия особого класса белков - "молекулярных шаперонов", основной функцией которых является обеспечение сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру, вызван проблемами, связанными с процессами денатурации и агрегации белков, происходящими вследствие нарушения их конформации при стрессорных воздействиях различного характера.
Молекулярные шапероны обладают способностью взаимодействовать с развернутыми или неправильно свернутыми белками, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации и приводит, в конечном итоге, к сохранению или восстановлению их на-тивного состояния. Многообразие действия шаперонов велико: они участвуют в различных внутриклеточных процессах, в том числе в ко-трансляционном фолдинге полипептидных цепей при их биосинтезе, транслокации белков через мембраны, включении индивидуальных белков в надмолекулярные структуры, они способствуют также солюбилизации агрегатов белков и их корректному рефолдингу [1-3].
Все известные в настоящее время шапероны обладают общими свойствами: они имеют гидрофобные домены, экспонированные на поверхности их молекулярных структур, способные узнавать и связывать определенные интермедиаты фолдинга белковых субстратов. В связи с много-
* Адресат для корреспонденции: 119071 Москва, Ленинский просп., д. 33; факс: (495)954-27-32; e-mail: bella@inbi.ras.ru
образием и широким спектром действий шаперонов в различных компартментах клетки интерес к ним не ослабевает, и список вновь открываемых шапероноподобных белков неуклонно растет. Однако несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов, структурно-функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны.
Образование биологически активной конформации белков часто осуществляется под действием системы ATP-зависимых шаперонов и кошапе-ронов, входящих в состав мультишаперонной сети [4-8]. Шапероны могут взаимодействовать между собой, создавая молекулярные ансамбли, участие в которых предполагает наличие в их структурах доменов, обладающих различными функциями. Некоторые из них ответственны за узнавание и связывание полипептидной цепи бел-ка-"клиента", другие участвуют в связывании шаперона-"партнера", третьи проявляют ферментативную активность АТРазы или фолдазы. В мультишаперонную сеть вовлекаются также различные пептиды и шапероноподобные белки, структура которых отличается от структуры известных "классических" шаперонов, и ферменты фолдинга - протеиндисульфидизомераза (protein disulfide isomerase, PDI; EC 5.3.4.1.), катализирующая образование нативных дисульфидных связей, и ротамаза - пептидил-пролил-цис-транс изо-мераза (peptidyl-propyl cis-trans isomerase, PPI; ЕС 5.2.1.8), катализирующая цис-транс изомери-
зацию имидных связей, предшествующих проли-ну в белках и пептидах [4, 5, 9-14].
PPI были первоначально идентифицированы как внутриклеточные рецепторы иммуносу-прессоров: циклоспорина A, FK506 и рапамицина, в связи с чем их назвали иммунофилинами [1517]. PPI широко распространены в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих). Они, как правило, не являются тканеспецифичными и обнаруживаются во всех внутриклеточных компартментах. Обнаружено несколько десятков PPI с молекулярной массой от 10 до 150 кДа. В большинстве случаев это полифункциональные белки. Помимо домена, обладающего ротамазной активностью, они содержат дополнительные домены, участвующие в белок-белковых взаимодействиях.
В настоящее время установлено, что PPI участвуют во многих фундаментальных клеточных процессах: фолдинге белков, регуляции некоторых мембранных рецепторов и каналов, апопто-зе. Однако данные о шаперонных функциях рота-маз, обладающих активностью PPI, весьма ограничены.
В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств одного из иммунофилинов - низкомолекулярного (12 kDa) цитоплазматического рецептора иммуносупрес-сора FK506 (FK506-Binding protein, FKBP12), проявляющего активность PPI. Наибольшее количество FKBP12 обнаружено в Т-лимфоцитах и в различных отделах мозга.
Целью настоящей работы является изучение шапероноподобных свойств FKBP12, идентифицированного в мозге быка [18-21], в тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики стресс-индуцируемой агрегации модельного белкового субстрата [22], в качестве которого выбран рекомбинантный инсулин человека.
Данный выбор обусловлен следующими соображениями: с одной стороны, развитие современных представлений о фолдинге и агрегации белков привело к обнаружению большого числа белков и пептидов со структурой, отличной от бета-амилоидного пептида, обладающих способностью к образованию амилоидоподобных структур, вызывающих различные нейродегенератив-ные заболевания [23]. Одним из интереснейших объектов исследования является инсулин, который образует аморфные агрегаты при диссоциации А- и В-цепей в результате восстановления связывающих их S-S-мостиков, однако при определенных условиях структурируется с образованием "амилоидных" фибрилл [24, 25].
С другой стороны, хотя вопросы, касающиеся развития нейродегенеративных и некоторых других заболеваний вследствие дисфункции инсулина и сигнальной системы мозга, реализуемой с
участием рецепторов инсулина, остаются во многом дискуссионными [26-29], исследования защитной роли шапероноподобных белков, связывающих инсулин и предотвращающих его агрегацию, могут представлять интерес для нейроэндокрино-логии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. Использовали: Tris, DEAE-Ser-vacel, акриламид, ^№-метиленбисакриламид, персульфат аммония, стандарты молекулярной массы, полиэтиленгликоль (20000 Da), дитиотре-итол фирмы Sigma (США); ацетонитрил, HPLC grade, фирмы Merck (Германия); трифторуксус-ную кислоту (ТФУ), sequence grade, фирмы Knauer (Германия); инсулин фирмы MP Biomedicals (Германия), DEAE- и HW-55 Toyopearl фирмы TOYO SODA (Япония); мембраны для ультрафильтрации PM 30 и UM 05 фирмы Amicon (США). Остальные реактивы были отечественного производства марки х.ч. или о.с.ч. Использовали воду, деионизованную с помощью аппарата Milli Q System (Millipore).
Получение экстракта мозга быка. Мозг, полученный на мясокомбинате, замораживали и хранили в течение длительного времени при температуре -70°С. Перед выделением ткань размораживали и гомогенизировали в 100 мМ Tris-HCl буфере, pH 7.8 (3:1), содержащем 100 мМ KCl, 5 мМ в-меркаптоэтанол ф-ME) и 1 мМ фенилме-тилсульфонил фторид (PMSF). Гомогенат центрифугировали при 10000g, 30 минут, затем су-пернатант - при 60000g, 1 ч на центрифуге L7 Beckman (США). Вторичный супернатант подвергали тепловой обработке при 58°С в течение 20 мин, образовавшийся преципитат отделяли центрифугированием при 60000 g, 1 ч. Супернатант подвергали ультрафильтрации через мембрану РМ 30, а затем концентрировали, используя ПЭГ 20000 или мембрану иМ 05. Полученный раствор диализовали против 20 мМ Tris-HCl буфера, pH 7.8, содержащего 5 мМ в-ME и 1 мМ PMSF.
Ионообменная хроматография. Диализат пропускали через ионообменную колонку 1.6 х 40 см с DEAE-Servacel, уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили в изократическом режиме со скоростью 1 мл/мин; объем фракций - 1 мл.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ. Для идентификации белков, элюированных с ионообменной колонки, соответствующие аликвоты белкового пика пропускали через фильтр фирмы Sartorius (0.45 мк). Фильтрат подвергали обратно-фазовой ВЭЖХ с использованием установки Gilson HPLC system (Франция) на колонках C8, Aquapore RP 300 (4.6 х 220 мм), Brownlee Labs (США) и C18 (4.6 х 220 мм), Vydac (США), снабженных предко-
Элюат, мл
Рис. 1. Профиль элюции белков с DEAE-Servacel. По оси ординат: содержание белка в элюате (оптическое поглощение при 280 нм); по оси абсцисс - объем фракций (мл).
лонками (3.2 х 15 мм). Элюцию осуществляли с помощью линейного градиента: 0.1% ТФУ -0.08% ТФУ в AcN (0-70%, 70 мин) со скоростью 0.5 мл/мин. Пики белка, детектированные по абсорбции при 214 нм, собирали и высушивали в вакуумном концентраторе Speedvac drier, фирмы Savant (США).
N-концевое микросеквенирование. Автоматическое микросеквенирование по Эдману проводили на секвенаторе модели 473 A, Applied Biosystems, Weiterstadt (Германия), снабженном системой анализа "on-line" производных фенилтиогиданто-ина. На фильтр картриджа наносили 50-150 пмоль белка в соответствии со стандартной методикой.
Масс-спектралъный анализ. Белки фракций, полученных с помощью ВЭЖХ (10-50 пмолей), растворяли в 0.1% ТФУ и подвергали масс-спек-тральному анализу на установке MALDI-MS (Kra-tos, MALDI II equipment, Shimadzu, Europe).
Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС). Шапероноподобную активность FKBP12 определяли, используя тест-систему, основанную на подавлении индуцированной 20 мМ дитиотреито-лом агрегации инсулина, использованного в качестве модельн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.