РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 6, с. 650-657
ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ
УДК 612.42:[577.2 +576]:539.1.04
СИГНАЛИЗАЦИЯ МЕЖДУ ЛИМФОЦИТАМИ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ ВОЗДЕЙСТВИЕМ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В АДАПТИРУЮЩИХ ДОЗАХ
© 2007 г. А. В. Ермаков, С. В. Костшк, Н. А. Еголина, Е. А. Калашникова, С. Н. Кокаровцева, Е. М. Малиновская, Н. Н. Вейко*
ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Ранее нами показано, что после воздействия рентгеновского излучения на лимфоциты человека в адаптирующей дозе (10 сГр) происходит транспозиция (перемещение) локусов гомологичных хромосом от мембраны к центру ядра; этот эффект сопровождается активацией ядрышкообразующих районов хромосом. Обе клеточные реакции передаются необлученным клеткам по механизму эффекта свидетеля. Установлено, что стресс-сигнализация опосредуется фрагментами внеклеточной ДНК, которые выделяются облученными клетками. В настоящей работе после подавления в облучаемых лимфоцитах активности каспазы 3, ключевого фермента апоптоза, или ингибирования клеточных рецепторов ("tolr'-рецепторы, TLR9) в лимфоцитах-свидетелях реакции перемещения локусов хромосом мы не наблюдали. Обсуждается сигнальный путь при эффекте свидетеля: апоптоз фракции облученных лимфоцитов - появление внеклеточной ДНК с измененными свойствами -взаимодействия фрагментов ДНК с рецепторами в клетках-свидетелях.
Малые дозы рентгеновского излучения, транспозиция локусов хромосом, эффект свидетеля, факторы стресс-сигнализации, апоптоз, Toll-like (TLR) рецепторы.
Эффект свидетеля (ЭС) - клеточная реакция, при которой после радиационного воздействия происходит передача сигнала (стресс-сигнализация, СС) от облученных клеток необлученным (клеткам-свидетелям), в результате в тех и других индуцируются одинаковые эффекты. Эта реакция была открыта на клетках китайского хомячка, когда после облучения а-частицами только 0.1-1% клеточных ядер наблюдали увеличение частоты сестринских хроматидных обменов (СХО) в 20-40% клеток [1]. Позже ЭС был показан для различных типов клеток и для повреждающих факторов самой разной природы [2-4]. В клетках-свидетелях обнаруживают широкий спектр реакций, включая апоптоз и адаптивный ответ (АО) [3-6]. Рассматривают три возможных пути передачи сигнала свидетелю: непосредственный клеточный контакт, взаимодействие через щелевидные контакты и через среду культивирования облученных клеток [3, 4, 7-9]. Для ЭС, индуцированного излучением с низкой ЛПЭ, наиболее характерен третий путь [10].
На роль факторов СС предложено много кандидатов [2-4], в основном белков. В нашей предыдущей работе мы впервые обратили внимание на возможное участие внеклеточной геномной ДНК
*Адресат для корреспонденции: 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1, МГНЦ РАМН; тел.: 8 (499) 612-81-93; факс: 8 (499) 324-07-02; e-mail: ribgene@rambler.ru.
(вкДНК) в реализации ЭС. Из среды инкубации облученных лимфоцитов были выделены фрагменты ДНК, способные в интактных клетках-свидетелях индуцировать наблюдаемые в подвергнутых действию радиации лимфоцитах реакции: транспозицию прицентромерных локусов хромосом и активацию синтеза рРНК [2]. Анализ литературных данных позволяет высказать предположение, что основным источником стимулирующих лимфоциты фрагментов вкДНК являются клетки, повышенно чувствительные к апопто-зу, индуцированному действием ионизирующего облучения [5, 11-15]. На связь апоптоза и ЭС указывают авторы работ, в которых было показано, что супрессоры апоптоза L-депренил (ингибитор моноаминоксидазы) и лактат могут эффективно ингибировать ЭС, стабилизируя клеточную мембрану [16, 17]).
Для развития аналогичных с наблюдаемыми в облученных лимфоцитах эффектов в клетках-свидетелях необходим контакт реципиентов с факторами СС, что может быть опосредовано клеточными рецепторами. Один из возможных кандидатов на роль рецепторов внеклеточной ДНК - это белки семейства "toll-like" рецепторов, обозначаемые как TLR9 [18]. Эти рецепторы экс-прессируются макрофагами, плазмацитоидными дендритными клетками, В-лимфоцитами и др. клетками. Являясь трансмембранными рецепторами, они содержат повтор для закрепления ли-
ганда и внутриклеточную высококонсервативную область, опосредующую взаимодействия между рецепторами и молекулами сигнального пути при участии адаптерных молекул. Лиганда-ми для TLR9 служат неметилированные CpG-мо-тивы ДНК. Связывание ДНК с ГГLR9 сопровождается активацией протеинкиназ семейства МАРК, фактора транскрипции №-кВ, увеличением синтеза ряда цитокинов и выработкой активных форм кислорода [19]. Неметилированные CpG-мотивы ДНК могут накапливаться в составе вкДНК среды облученных клеток. К таким последовательностям можно, например, отнести транскрибируемую область рибосомного повтора, которая содержит очень много мотивов связывания с TLR9. Фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора, во-первых, накапливаются во вкДНК человека и, во-вторых, обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты человека, вызывая те же эффекты, что и радиация в малых дозах [20-22].
Цель данного исследования - проверка гипотезы о существовании пути стресс-сигнализации между облученными лимфоцитами и лимфоцитами-свидетелями: апоптоз радиочувствительной фракции клеток - образование внеклеточной ДНК - активация ими клеточных рецепторов TLR9.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов. Нестимулированные С0-лимфоциты выделяли из гепаринизированной периферической крови здоровых доноров в системе фиколл-урографин ("ПанЭко", Россия).
Облучение клеток. Лимфоциты облучали при 20°С на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Амплитуда напряжения на рентгеновской трубке ~160 кВ, максимум в спектре излучения ~60 кэВ. Мощность дозы составляла 0.16 Гр/мин.
Определение активности каспазы 3. Выделенные лимфоциты выдерживали в течение 30 мин при 37°С, подвергали воздействию рентгеновского излучения (10 сГр) и инкубировали в течение 2 ч при той же температуре. Клетки осаждали центрифугированием, уровень ферментативной активности каспазы 3 в белковых лизатах определяли по стандартной методике [23, 24] с использованием набора реагентов для определения активности каспазы 3 ("С1ойеЛ"). В качестве субстрата набор содержит пара-нитроанилидное производное тетрапептида Ас^Е"УС-р^ Контрольные пробы обрабатывали перед добавлением субстрата ингибирором каспазной активности Ac-DEVD-CHO. Результаты получали в единицах оптической плотности при 405 нм раствора пара-нитроанилида на единицу ДНК после 1 ч инкуби-
рования белковых лизатов с субстратом при 33°С. Активность каспазы 3 определяли в расчете на единицу ДНК, поскольку содержание ДНК для неделящихся клеток пропорционально количеству клеток.
Оценка активности фактора некроза опухоли (ФНО-а). Выделенные лимфоциты после 30-минутной инкубации (37°С) облучали в дозе 10 сГр и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием, в супер-натантах изучали активность ФНО-а. Данный параметр определяли по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток мышиной фиб-росаркомы L-929 [25]. В лунки с монослоем клеток вносили по 100 мкл образцов надосадоч-ной жидкости или стандартных разведений ФНО-а (каждый образец - в 4 лунки), а также актиноми-цин D ("Sigma") в концентрации 2 мкг на лунку. Клетки инкубировали в течение 18-20 ч при 37°С и 5% СО2. Результаты реакции учитывали путем окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым. Оптическую плотность растворов в лунках измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом ("ЭФОС", Россия) при длине волны 594 нм. В качестве стандарта использовали рекомбинант-ный ФНО-а человека ("ДиаМ", Москва). Кривые титрования оценивали с помощью метода про-бит-анализа, выражая активность ФНО-а в образцах в ME/мл.
Блокировка этапов стресс-сигнализации. Первый этап сигнального пути - апоптотический - останавливали введением в культуральную среду ингибитора активности каспазы 3 Biotin-DEVD-FMK ("Sigma") в конечной концентрации 2 мкмоль/л [26]. Второй этап - рецепторный - перекрывали блокированием TLR9 путем добавления в среду олигонуклеотида TCC TGG CGG GGA AGT (2088) ("Синтол", Москва) в конечной концентрации 3 мкг/мл [27], либо хлорокина ("Boots Company PLC", Англия) в концентрации 2 мкг/мл [28]. После внесения в культуральную среду каждого из ингибиторов клетки инкубировали до начала какого-либо воздействия 30 мин при 37°С.
Выделение из ростовой среды фрагментов ДНК. Клетки осаждали центрифугированием (460 g) и к 3 мл среды культивирования добавляли 1% лаурилсаркозинат натрия, 0.02 моль/л ЭДТА и 75 мкг/мл РНКазы А ("Sigma"). Клеточную суспензию инкубировали в течение 45 мин, после чего в нее вносили протеиназу К (200 мкг/мл). Гидролиз белков протеиназой К осуществляли в течение 24 ч при 37°С. Далее дважды проводили экстракцию ДНК насыщенным раствором фенола, и ДНК осаждали двумя объемами этанола в присутствии 2 моль/л раствора ацетата аммония. Осадок дважды промывали 75%-ным этанолом, высушивали и растворяли в воде. Концентрацию фрагментов ДНК определяли методом флуорес-
ценции их при связывании с красителем Hoechst 33528.
Культивирование клеток (эффект свидетеля). Лимфоциты переводили в среду, содержащую раствор Хенкса, 1 ммоль/л HEPES ("Fluka") и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Hy-Clone", США), и суспензию делили на три части. После прибавления к одной части клеточной суспензии ингибитора каспазы 3 все клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С, затем лимфоциты подвергали воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 сГр. В результате получали три параллелльные пробы: первая - интактные клетки; вторая - облученные лимфоциты; третья -клетки, облученные после введения ингибитора. Лимфоциты (2 х 106 кл/мл) инкубировали в течение 2 ч при 37°С, осаждали центрифугированием, подвергали гипотонизации и фиксировали; супер-натанты замораживали. В других независимых экспериментах из размороженных препаратов выделяли фрагменты внеклеточной ДНК, используя их как факторы СС для клеток-свидетелей. Для этого выделенные лимфоциты того же донора делили на пять частей и,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.