научная статья по теме СИЛИКАТЕИНЫ ПРЕСНОВОДНЫХ ГУБОК: СРАВНЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ЭКЗОН-ИНТРОННЫХ СТРУКТУР ГЕНОВ Биология

Текст научной статьи на тему «СИЛИКАТЕИНЫ ПРЕСНОВОДНЫХ ГУБОК: СРАВНЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ЭКЗОН-ИНТРОННЫХ СТРУКТУР ГЕНОВ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 4, с. 617-626

ГЕНОМИКА.

ТРАНСКРИПТОМИКА

УДК 577.212.3

СИЛИКАТЕИНЫ ПРЕСНОВОДНЫХ ГУБОК: СРАВНЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ЭКЗОН-ИНТРОННЫХ СТРУКТУР ГЕНОВ

© 2011 г. О. В. Калюжная1*, А. Г. Красько2, В. А. Гребенюк2, В. Б. Ицкович1, Н. А. Семитуркина1, И. С. Соловаров1, W. E. G. Mueller2, С. И. Беликов1

1Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск, 664033 2Institutfür Physiologische Chemie, Iohann Gutenberg Universität, Mainz, D-55099, Germany

Поступила в редакцию 09.07.2010 г.

Принята к печати 13.12.2010 г.

Кремнистые спикулы губок содержат силикатеины — белки, участвующие в осаждении биогенного кремнезема и определяющие морфологические особенности спикул. Исследована экзон-интронная организация генов четырех изоформ силикатеина-а (-а1, -а2, -а3 и -а4) эндемичной байкальской губки Lubomirskia baicalensis. Определены 17 последовательностей фрагментов генов различных изоформ си-ликатеинов восьми видов пресноводных губок, включающих как космополитных представителей (Spongilla lacustris, Ephydatia muelleri, E. fluviatilis), так и эндемиков Байкала (L. baicalensis, L. in-crustans, Baikalospongia intermedia, B. fungiformis, Srn papyracea). Показано, что космополитные и эндемичные губки отличаются между собой по структуре генов, а именно — имеют интроны разной длины. Из байкальских видов наибольшей вариабельностью длин интронов отличается ген силикатеина-а1, а наиболее консервативным в этом отношении является ген силикатеина-а4. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей различных изоформ силикатеинов показал, что имеются четыре кластера внутри клады пресноводных губок. Филогенетический анализ экзон-интронных последовательностей генов дает возможность разделять близкородственные виды губок внутри кластеров.

Ключевые слова: пресноводные губки, силикатеин, экзон-интронная структура гена, филогенетический анализ.

FRESHWATER SPONGE SILICATEINS: COMPARISON OF SEQUENCES AND EXON-INTRON STRUCTURE OF GENES, by O. V. Kaluzhnaya1*, A. G. Krasko2, V. A. Grebenjuk2, V. B. Itskovich1, N. A. Semiturkina1, I. S. Solovarov1,W. E. G. Mueller2, S. I. Belikov1 (1Limnological Institute, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Irkutsk, 664033 Russia, *e-mail: x-sun77@rambler.ru; 2Institut für Physiologische Chemie, Iohann Gutenberg Universität, Mainz, D-55099, Germany). Siliceous sponge spicules contain silicateins — proteins taking part in biogenic silica precipitation and determination of the spicule morphological features. The exon-intron structure of four silicatein-a isoforms: -a1,-a2, -a3 and -a4 from endemic baikalian sponge Lubomirskia baicalensis was studied. For eight sponge species, including both cosmopolitan (Spongilla lacustris, Ephydatia muelleri, E. fluviatilis) and Baikal endemic (L. baicalensis, L. incrustans, Baikalospongia intermedia, B. fungiformis, Sw. papyracea) species, seventeen gene fragment sequences of different silicatein isoforms were determined. It was shown that cosmopolitan and endemic Baikalian sponges differ from each other by gene structure (have different length of introns). Among Baikalian sponges silicatein-a1 has the most variable intron length, and silicatein-a4 is the most conservative. Phylogenetic analysis of amino-acid silicatein sequences allow identify different silicatein isoforms, which authentically differ form four clusters on phylogenetic tree. Phylogenetic analysis of exon-intron sequences gives the possibility to separate different sponge species in the clusters.

Keywords: freshwater sponges, silicatein, exon-intron structure of gene, amino-acid sequences, phylogenetic analysis.

Силикатеины — белки спикул кремнистых губок. Впервые аминокислотная последовательность силикатеина из морской губки ТвЖуа аыгаШ1а была определена в 1998 г. [1]. Этот белок входит в состав аксиального филамента спикул и ускоряет полимеризацию кремниевых алоксидов [1, 2]. Вскоре ген аналогичного белка был обнаружен в спикулах мор-

* Эл. почта: x-sun77@rambler.ru

ской губки БыЪвгНвз (отыпсы1а [3], затем исследовали гены силикатеинов в геномах морских губок Рвй-оз1а Аа/огт1з [4, 5], НутвтаеМопрвНЫз [6] и Ово-(Иа су(општ [7], Сга1вготогрНа твувп [8], Ьа1гыпеыИа ораппав и ЛеаПкойвпйтШа 8р. [9]. В настоящее время известны последовательности мРНК двух групп си-ликатеинов (а и в) морских губок. Анализируя последовательности этих белков, обнаружили их сход-

ство с известным семейством папаин-подобных ци-стеиновых протеаз (эндонуклеаз) — катепсинов L [1]. В опытах in vitro силикатеины гидролизуют эфи-ры кремниевой кислоты, что приводит к отложению аморфного кремнезема [2, 3, 10, 11] и формированию филаментных структур [12, 13]. Кроме того, эти белки определяют морфологические черты спикул, которые являются важным признаком видовой идентификации губок [14].

Работы по изучению силикатеинов пресноводных губок проводятся с 2005 г. Найдены четыре изо-формы силикатеина-а у космополитной губки E.fluviatilis и эндемичной байкальской губки L. ba-icalensis. Последовательностей, гомологичных гену силикатеина-в, в геноме пресноводных губок не обнаружено [11, 15, 16]. Установлено, что экспрессия генов каждой из изоформ силикатеина E. fluviatilis происходит на различных этапах формирования спикул [14]. По-видимому, в процессах образования основного филамента и отложения дополнительных слоев кремнезема на поверхность спикулы участвуют разные изоформы силикатеина [14].

Объект нашего исследования — пресноводные губки космополитного семейства Spongillidae и эндемичного байкальского семейства Lubomirskiidae. Последнее включает 13 видов губок [17], дивергенция которых от общего предка произошла относительно недавно [18]. Распознавание этих видов по морфологии часто затруднено, а классические молекулярные маркеры (гены СОХ1, 18S рРНК, участки внутренних транскрибируемых спейсеров — ITS) информативны лишь на уровне рода и семейства [18]. Поскольку изменения, возникающие в процессе видообразования и эволюции, затрагивают также белоккодирующие гены, в том числе гены, участвующие в образовании скелета, перспективно проведение сравнительного анализа последовательностей этих генов и их экзон-интронных структур у различных видов губок. Изучение интронов генов особенно интересно в связи с тем, что скорость накопления мутаций в этих участках довольно высока [19]. Кроме того, не исключено, что такие характеристики интронов, как вариабельность длины, положение в гене, отношение к длине экзона и иные могут быть связаны и со свойствами генов (экспрессией, транскрипцией, сплайсингом, временем жизни мРНК и т.д.), и с эволюцией организма в целом [19, 20].

Поэтому мы предприняли изучение экзон-ин-тронных структур генов и соответствующих аминокислотных последовательностей силикатеинов разных видов пресноводных губок с целью поиска ви-доспецифичных особенностей, которые могут быть применимы для молекулярной идентификации близкородственных видов губок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Сбор материала. Образцы байкальских губок собраны в ходе экспедиций 2005—2006 гг. в районе пос. Большие Коты (юго-западное побережье оз. Байкал), вблизи о. Ольхон (западное побережье) на глубине 5—15 м, а также в 2008 г. у мыса Толстый (Южный Байкал) с глубины 307 м (в ходе экспедиции "МИРы на Байкале"). Виды пресноводных губок, исследуемые в данной работе, перечислены в таблице. Экземпляры, которые использовали для выделения РНК, замораживали в жидком азоте. Образцы, из которых затем выделяли ДНК, помещали в 70%-ный раствор этанола и хранили при 4°C.

Выделение ДНК, РНК и амплификация. Для

определения последовательностей нуклеотидов суммарную ДНК из образцов губок выделяли по методике, прилагающейся к набору "QIAGEN RNA/DNA". Качество ДНК определяли при помощи электрофореза в 0.6%-ном геле агарозы. Суммарную РНК выделяли из свежих образцов губок или из образцов, хранившихся в жидком азоте, используя набор "Trizol Reagent" ("Sigma") по протоколу фирмы. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора реактивов "Реверта" ("АмплиСенс") согласно прилагающейся инструкции. Продукты амплификации для определения полноразмерных экзон-интронных последовательностей генов получали с использованием праймеров, сконструированных на основе соответствующих известных последовательностей кДНК гена силикатеина-а1, как было описано ранее [16]. Фрагменты генов силика-теина-а различных видов губок амплифицировали с использованием праймеров Sil_F1 и Sil_R1, структуры которых определяли, исходя из наиболее консервативных участков генов силикатеинов L. ba-icalensis с учетом положения интронов (в скобках указано положение на последовательности кДНК силикатеина-а 1):

Sil_F1 - GGTCAGTGTGGCGCTAGCTATGC (385-407),

Sil_R1 - CTGTTCTTAACAAGCCAGTAAT (860-881).

С этими же праймерами амплифицировали фрагменты кДНК силикатеинов. Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси на амплификаторе MiniCycler ("MJ Research") в следующем режиме: предварительный прогрев смеси, активация полимеразы 5 мин при 94°С; 35 циклов, включающих денатурацию ДНК (45 с при 94°С); отжиг праймеров (60 с при 56°С) и элонгацию (90 с при 72°С); финальная элонгация (10 мин при 72°С). Ииндивидуальные ПЦР-фраг-менты анализировали путем электрофореза в 0.8%-ном геле агарозы, после чего экстрагировали, используя набор "PCR clean-up Gel extraction Nu-cleoSpin Extract II" ("Macherey-Nagel") по методике производителя.

Виды губок, исследованных в данной работе

Вид/Место сбора (для видов, исследованных в данной работе)

Изоформа силикатеина

Номер в банке данных (GenBank)

Последовательности (фрагменты генов или кДНК), полученные в данной работе

8Шса1ет-а1 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а4 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а2 (полный ген) 8Шса1ет-а3 (полный ген) 8Шса1ет-а4 (полный ген) 8Шса1ет-а1 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а4 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а1 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а2 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а3 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а4 (фрагмент гена) 8Шса1ет-а4 (фрагмент гена)

ЬыЪотткла тсгШат/оз. Байкал, Средняя котловина, восточное побережье

Ь. Ъаюа1

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком