научная статья по теме СИНХРОТРОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН ORAL STRATUM CORNEUM Химия

Текст научной статьи на тему «СИНХРОТРОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН ORAL STRATUM CORNEUM»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 1, с. 129-136

ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ

УДК 577.352.27

СИНХРОТРОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН ORAL STRATUM CORNEUM

© 2014 г. Н. Ю. Рябова1' 2, А. Ю. Грузинов3, А. В. Забелин3

1 Объединенный институт ядерных исследований, Дубна E-mail: rny03@nf.jinr.ru 2 Научно-исследовательский институт ядерной физики МГУ им. М.В. Ломоносова 3Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", Москва Поступила в редакцию 06.06.2013 г.

Методом рентгеновской синхротронной дифракции исследованы мембраны, моделирующие ли-пидную фракцию слизистой оболочки ротовой полости человека. Тройные системы, составленные из смеси сфингомиелина, дипальмитоилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилэтанол-амина с весовым соотношением компонентов 1 : 2 : 2 и 1 : 2 : 1, при физиологической температуре (37°С) являются ламеллярными структурами в гелевой фазе. В системе с 40%-ным дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина в температурном интервале 60—70°С образуется инвертированная гексагональная фаза, сосуществующая с жидкокристаллической ламеллярной фазой в узком интервале температур и полностью подавляющая ламеллярную фазу при повышении температуры до 80°C. Многокомпонентные мембраны oral stratum corneum характеризуются несколькими ламеллярными фазами при 20—37°C и сосуществованием одной или нескольких ламеллярных фаз с инвертированной гексагональной фазой при 80—90°C.

DOI: 10.7868/S0023476114010123

ВВЕДЕНИЕ

Слой эпителия, покрывающий ротовую полость, как и верхний слой кожи млекопитающих stratum corneum (SC), выполняет роль барьера, защищающего нижележащие ткани и контролирующего проникновение веществ через слизистую оболочку. Этот слой по аналогии с SC обозначают как oral stratum corneum (OSC). Проницаемость OSC приблизительно в 10 раз выше проницаемости эпидермального SC и несколько разнится для кератинизированных и некератинизированных областей эпителия [1]. Электронная микроскопия выявила, что межклеточное вещество OSC является важнейшим путем проникновения веществ через слизистую, как и липидная матрица в SC [2, 3]. До 47% межклеточного вещества OSC составляют десмосомы, тогда как в SC их доля не превышает 15% [4]. По данным трансмиссионной электронной микроскопии, OSC имеет малое количество плохо ориентированных липидных ла-мелл [4, 5].

В отличие от липидной составляющей stratum corneum OSC содержит значительное количество фосфолипидов и гликолипидов, среди которых наиболее распространенными являются сфинго-миелин (СФМ), фосфатидилхолин и фосфатидил-этаноламин; кроме них содержится небольшое количество фосфатидилсерина и фосфатидил-инозитола. Как и в SC, в OSC присутствуют холестерин и его производные, церамиды (за исклю-

чением длинноцепочечных церамидов) и жирные кислоты (ЖК) [1, 6]. Обнаруженная зависимость между проницаемостью и липидным составом позволяет предположить, что церамиды могут играть важную роль в формировании барьерных свойств 08С. Так, некератинизированный эпителий, содержащий меньшее количество церами-дов, чем кератинизированные участки, имеет большую проницаемость по сравнению с керати-низированным эпителием [1]. В [5] обнаружена обратная корреляция проницаемости 08С с содержанием церамидов и прямая — с содержанием триглицеридов.

Хотя липидный состав слоя 08С хорошо определен, его структура и ее влияние на барьерные свойства изучены не так подробно, как в случае 8С. Основываясь на липидном составе, авторы [7] предположили, что при физиологических условиях существуют не очень протяженные липидные домены в гелевой фазе, однако экспериментального подтверждения этого предположения нет. В настоящей работе был применен метод рентгеновской синхротронной дифракции для изучения структуры систем, моделирующих липидную составляющую слизистой оболочки рта.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД

Материалы и приготовление образцов. Ы-(а-гидроксооктадеканоил)-фитосфингозин (церамид-6) синтезирован фирмой "Со8шо1:егт" (Нидерлан-

9

129

ды). Холестерин, сульфат холестерина, ЖК, ди-пальмитоилфосфатидилэтаноламин, сфингомие-лин (выделенный из бычьего мозга) приобретены в фирме " Sigma-Aldrich", дипальмитоилфосфа-тидилхолин — в фирме "Lipoid".

Липидный состав природной слизистой весьма разнообразен, но при создании упрощенных модельных систем ограничимся несколькими классами липидов, включая наиболее распространенные. Отдельно были приготовлены мембраны из смеси СФМ, дипальмитоилфосфатидилэтанол-амина (ДПФЭ) и дипальмитоилфосфатидилхо-лина (ДПФХ) и мембраны, включающие в себя кроме этих липидов холестерин (Хол), сульфат холестерина (СХол), свободные ЖК и церамид 6 (Цер6), который среди других короткоцепочеч-ных церамидов является наиболее изученным в составе мембран, моделирующих липидную матрицу эпидермального SC [8—11]. Использование схожих компонентов в модельных мембранах OSC и SC позволит сравнить структурные особенности мембран обоих тканей.

Для приготовления образцов в виде водных суспензий мультислойных везикул (МСВ) сухие липиды растворялись в органическом растворителе (смесь хлороформа и метанола в массовом соотношении 2:1) при концентрации липида 10 мг/мл. Затем полученный раствор осаждался на твердую подложку для образования липидной пленки ориентированных мультислоев. Высушенная пленка растворялась в избытке воды (Milli Q, pH 5.8) или в 20 мМ трис-буфере, содержащем 100 мМ NaCl (pH 8.4). Концентрация липидов в воде составляла 10—15 мас. %. Полученный раствор подвергали многократному нагреву в термомиксере до 80°С в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и затем помещали в кварцевые капилляры диаметром 1.5 мм и толщиной стенки 0.01 мм.

Для исследований были приготовлены МСВ следующих модельных липидных систем: смеси сфингомиелен/фосфолипиды СФМ/ДПФХ/ДП-ФЭ c массовым соотношением компонентов 1 : 2 : 2 (обозначим мембрану как ФЛ1) и 1 : 2 : 1 (мембрана ФЛ2) в воде, мембраны OSC с составом Цер6/Хол/ЖК/CХол/ФЛ2 и массовым соотношением 28 : 23 : 15 : 8 : 26 в избытке воды и трис-буфере с pH 8.4. Для выявления влияния ЖК на структуру модельных мембран OSC были приготовлены системы Цер6/Хол/ЖК/СХол/ФЛ2 с разными насыщенными ЖК: пальмитиновой (ПК, C16:0), арахиновой (АК, С20:0), бегеновой (БК, С22:0), лигноцериновой (ЛК, С24:0) и церо-тиновой (ЦК, С26:0).

Эксперименты по дифракции синхротронного излучения выполнены на станции ДИКСИ накопительного кольца "Сибирь-2" в НИЦ "Курчатовский институт". Рентгенограммы регистрировались двумерным детектором MarCCD при дли-

не волны падающего излучения X = 1.62 А и расстоянии образец—детектор ~ 280 мм. Уточнение расстояния проводилось с помощью ди-фрактограммы бегетана серебра (^001 = 58.38 А). Образцы измерялись при выбранных значениях температуры в диапазоне от 20 до 90°С. Время экспозиции каждой дифрактограммы составляло 5—7 мин. Перед каждым измерением образец уравновешивался при заданной температуре не менее 5 мин. Свертка экспериментальных данных в кривую рассеяния /(#) как функцию вектора рассеяния q проводилась с помощью программы Fit2D. Период повторяемости ламеллярной структуры липидной мембраны d рассчитывался из положений равновесия дифракционных рефлексов. Параметр двумерной гексагональной фазы определялся по положению брэгговских рефлексов с индексами Миллера (кк) от этой фазы

согласно формуле a =

4 nl h2 + к2 + кк

УнкЛ

Распределение плотности длины рассеяния электронов в направлении нормали к поверхности мембраны р(х) (фурье-профиль мембраны) рассчитывалось с помощью стандартной процедуры фурье-преобразования экспериментальных структурных факторов:

р(х) = F0 + £ Ф/ cos

(1)

Здесь структурные факторы/к рассчитаны из интегральной интенсивности дифракционных пиков с учетом фактора Лоренца, равного к2 для МСВ, и нормированы на первый структурный фактор = (1к • к2)1/2, /к = \Fk\f\Fi\. Средняя

электронная плотность Ш0 принята равной нулю, поскольку она никак не влияет на определение величины .0НН. Знаки структурных факторов фп определялись подбором следующим образом. N дифракционных рефлексов имеют 2п комбинаций знаков фп. Были проверены все возможные комбинации, в качестве верной выбрана единственная комбинация, приводящая к физически разумному профилю р(х) [12].

Толщина липидного бислоя Бнн в настоящей работе определена как расстояние между двумя максимумами фурье-профиля мембраны. Положение максимумов находили с помощью анализа профиля модельной функцией, состоящей из суммы симметричных функций Гаусса, описывающих симметричные группы полярных голов и группы СН2, и одной функции Гаусса, соответствующей группе СН3. Для определения БНН использовали полученное значение положения функции Гаусса, соответствующей группе полярных голов ХНН: БНН = 2ХНН. Статистическая ошибка А^НН рассчитывалась из ошибки опреде-

ления XHH, полученной при анализе фурье-профиля модельной функцией в программе PeakFit (AISN Software Inc.). Как показано в [13, 14], точность определения толщины липидного бислоя, полученной из анализа фурье-профиля мембраны, восстановленного по конечному числу дифракционных пиков (по четырем—шести пикам), составляет ~0.5—1 А.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Дифракция на мембранах смесей сфингомие-лин/фосфолипиды. На рис. 1 представлены дифракционные картины от структуры смеси фос-фолипидов и сфингомиелина ФЛ1 = СФМ/ДП-ФХ/ДПФЭ с соотношением компонентов 1 : 2 : 2, измеренные в диапазоне температур 22—90°С. При 22° С на дифракционной картине четко видны четыре дифракционных пика от ламеллярной структуры с периодом повторяемости 72.2 А.

На рис. 2 представлены температурные зависимости периода повторяемости й и толщины липидного бислоя Внн, рассчитанной из функции распределения плотности длины рассеяния электронов с комбинацией знаков —, —, +, —, — для первых пяти дифракционных рефлексов. При увеличении температуры до 55°С период повторяемости уменьшается до 71.4 А, а толщина липидного бислоя постепенно сужается с 51.1 до 50.1 А. Пятый дифракционный пик появляется на

1 2

3

4

5

6

7

8

9

10

q,

Рис. 1. Дифракционные спектры от структуры тройной системы ФЛ1 = СФМ/ДПФХ/ДПФЭ = 1 : 2 : 2, измеренные

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»