КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 1, с. 129-136
ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ
УДК 577.352.27
СИНХРОТРОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН ORAL STRATUM CORNEUM
© 2014 г. Н. Ю. Рябова1' 2, А. Ю. Грузинов3, А. В. Забелин3
1 Объединенный институт ядерных исследований, Дубна E-mail: rny03@nf.jinr.ru 2 Научно-исследовательский институт ядерной физики МГУ им. М.В. Ломоносова 3Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", Москва Поступила в редакцию 06.06.2013 г.
Методом рентгеновской синхротронной дифракции исследованы мембраны, моделирующие ли-пидную фракцию слизистой оболочки ротовой полости человека. Тройные системы, составленные из смеси сфингомиелина, дипальмитоилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилэтанол-амина с весовым соотношением компонентов 1 : 2 : 2 и 1 : 2 : 1, при физиологической температуре (37°С) являются ламеллярными структурами в гелевой фазе. В системе с 40%-ным дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина в температурном интервале 60—70°С образуется инвертированная гексагональная фаза, сосуществующая с жидкокристаллической ламеллярной фазой в узком интервале температур и полностью подавляющая ламеллярную фазу при повышении температуры до 80°C. Многокомпонентные мембраны oral stratum corneum характеризуются несколькими ламеллярными фазами при 20—37°C и сосуществованием одной или нескольких ламеллярных фаз с инвертированной гексагональной фазой при 80—90°C.
DOI: 10.7868/S0023476114010123
ВВЕДЕНИЕ
Слой эпителия, покрывающий ротовую полость, как и верхний слой кожи млекопитающих stratum corneum (SC), выполняет роль барьера, защищающего нижележащие ткани и контролирующего проникновение веществ через слизистую оболочку. Этот слой по аналогии с SC обозначают как oral stratum corneum (OSC). Проницаемость OSC приблизительно в 10 раз выше проницаемости эпидермального SC и несколько разнится для кератинизированных и некератинизированных областей эпителия [1]. Электронная микроскопия выявила, что межклеточное вещество OSC является важнейшим путем проникновения веществ через слизистую, как и липидная матрица в SC [2, 3]. До 47% межклеточного вещества OSC составляют десмосомы, тогда как в SC их доля не превышает 15% [4]. По данным трансмиссионной электронной микроскопии, OSC имеет малое количество плохо ориентированных липидных ла-мелл [4, 5].
В отличие от липидной составляющей stratum corneum OSC содержит значительное количество фосфолипидов и гликолипидов, среди которых наиболее распространенными являются сфинго-миелин (СФМ), фосфатидилхолин и фосфатидил-этаноламин; кроме них содержится небольшое количество фосфатидилсерина и фосфатидил-инозитола. Как и в SC, в OSC присутствуют холестерин и его производные, церамиды (за исклю-
чением длинноцепочечных церамидов) и жирные кислоты (ЖК) [1, 6]. Обнаруженная зависимость между проницаемостью и липидным составом позволяет предположить, что церамиды могут играть важную роль в формировании барьерных свойств 08С. Так, некератинизированный эпителий, содержащий меньшее количество церами-дов, чем кератинизированные участки, имеет большую проницаемость по сравнению с керати-низированным эпителием [1]. В [5] обнаружена обратная корреляция проницаемости 08С с содержанием церамидов и прямая — с содержанием триглицеридов.
Хотя липидный состав слоя 08С хорошо определен, его структура и ее влияние на барьерные свойства изучены не так подробно, как в случае 8С. Основываясь на липидном составе, авторы [7] предположили, что при физиологических условиях существуют не очень протяженные липидные домены в гелевой фазе, однако экспериментального подтверждения этого предположения нет. В настоящей работе был применен метод рентгеновской синхротронной дифракции для изучения структуры систем, моделирующих липидную составляющую слизистой оболочки рта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД
Материалы и приготовление образцов. Ы-(а-гидроксооктадеканоил)-фитосфингозин (церамид-6) синтезирован фирмой "Со8шо1:егт" (Нидерлан-
9
129
ды). Холестерин, сульфат холестерина, ЖК, ди-пальмитоилфосфатидилэтаноламин, сфингомие-лин (выделенный из бычьего мозга) приобретены в фирме " Sigma-Aldrich", дипальмитоилфосфа-тидилхолин — в фирме "Lipoid".
Липидный состав природной слизистой весьма разнообразен, но при создании упрощенных модельных систем ограничимся несколькими классами липидов, включая наиболее распространенные. Отдельно были приготовлены мембраны из смеси СФМ, дипальмитоилфосфатидилэтанол-амина (ДПФЭ) и дипальмитоилфосфатидилхо-лина (ДПФХ) и мембраны, включающие в себя кроме этих липидов холестерин (Хол), сульфат холестерина (СХол), свободные ЖК и церамид 6 (Цер6), который среди других короткоцепочеч-ных церамидов является наиболее изученным в составе мембран, моделирующих липидную матрицу эпидермального SC [8—11]. Использование схожих компонентов в модельных мембранах OSC и SC позволит сравнить структурные особенности мембран обоих тканей.
Для приготовления образцов в виде водных суспензий мультислойных везикул (МСВ) сухие липиды растворялись в органическом растворителе (смесь хлороформа и метанола в массовом соотношении 2:1) при концентрации липида 10 мг/мл. Затем полученный раствор осаждался на твердую подложку для образования липидной пленки ориентированных мультислоев. Высушенная пленка растворялась в избытке воды (Milli Q, pH 5.8) или в 20 мМ трис-буфере, содержащем 100 мМ NaCl (pH 8.4). Концентрация липидов в воде составляла 10—15 мас. %. Полученный раствор подвергали многократному нагреву в термомиксере до 80°С в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и затем помещали в кварцевые капилляры диаметром 1.5 мм и толщиной стенки 0.01 мм.
Для исследований были приготовлены МСВ следующих модельных липидных систем: смеси сфингомиелен/фосфолипиды СФМ/ДПФХ/ДП-ФЭ c массовым соотношением компонентов 1 : 2 : 2 (обозначим мембрану как ФЛ1) и 1 : 2 : 1 (мембрана ФЛ2) в воде, мембраны OSC с составом Цер6/Хол/ЖК/CХол/ФЛ2 и массовым соотношением 28 : 23 : 15 : 8 : 26 в избытке воды и трис-буфере с pH 8.4. Для выявления влияния ЖК на структуру модельных мембран OSC были приготовлены системы Цер6/Хол/ЖК/СХол/ФЛ2 с разными насыщенными ЖК: пальмитиновой (ПК, C16:0), арахиновой (АК, С20:0), бегеновой (БК, С22:0), лигноцериновой (ЛК, С24:0) и церо-тиновой (ЦК, С26:0).
Эксперименты по дифракции синхротронного излучения выполнены на станции ДИКСИ накопительного кольца "Сибирь-2" в НИЦ "Курчатовский институт". Рентгенограммы регистрировались двумерным детектором MarCCD при дли-
не волны падающего излучения X = 1.62 А и расстоянии образец—детектор ~ 280 мм. Уточнение расстояния проводилось с помощью ди-фрактограммы бегетана серебра (^001 = 58.38 А). Образцы измерялись при выбранных значениях температуры в диапазоне от 20 до 90°С. Время экспозиции каждой дифрактограммы составляло 5—7 мин. Перед каждым измерением образец уравновешивался при заданной температуре не менее 5 мин. Свертка экспериментальных данных в кривую рассеяния /(#) как функцию вектора рассеяния q проводилась с помощью программы Fit2D. Период повторяемости ламеллярной структуры липидной мембраны d рассчитывался из положений равновесия дифракционных рефлексов. Параметр двумерной гексагональной фазы определялся по положению брэгговских рефлексов с индексами Миллера (кк) от этой фазы
согласно формуле a =
4 nl h2 + к2 + кк
УнкЛ
Распределение плотности длины рассеяния электронов в направлении нормали к поверхности мембраны р(х) (фурье-профиль мембраны) рассчитывалось с помощью стандартной процедуры фурье-преобразования экспериментальных структурных факторов:
р(х) = F0 + £ Ф/ cos
(1)
Здесь структурные факторы/к рассчитаны из интегральной интенсивности дифракционных пиков с учетом фактора Лоренца, равного к2 для МСВ, и нормированы на первый структурный фактор = (1к • к2)1/2, /к = \Fk\f\Fi\. Средняя
электронная плотность Ш0 принята равной нулю, поскольку она никак не влияет на определение величины .0НН. Знаки структурных факторов фп определялись подбором следующим образом. N дифракционных рефлексов имеют 2п комбинаций знаков фп. Были проверены все возможные комбинации, в качестве верной выбрана единственная комбинация, приводящая к физически разумному профилю р(х) [12].
Толщина липидного бислоя Бнн в настоящей работе определена как расстояние между двумя максимумами фурье-профиля мембраны. Положение максимумов находили с помощью анализа профиля модельной функцией, состоящей из суммы симметричных функций Гаусса, описывающих симметричные группы полярных голов и группы СН2, и одной функции Гаусса, соответствующей группе СН3. Для определения БНН использовали полученное значение положения функции Гаусса, соответствующей группе полярных голов ХНН: БНН = 2ХНН. Статистическая ошибка А^НН рассчитывалась из ошибки опреде-
ления XHH, полученной при анализе фурье-профиля модельной функцией в программе PeakFit (AISN Software Inc.). Как показано в [13, 14], точность определения толщины липидного бислоя, полученной из анализа фурье-профиля мембраны, восстановленного по конечному числу дифракционных пиков (по четырем—шести пикам), составляет ~0.5—1 А.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Дифракция на мембранах смесей сфингомие-лин/фосфолипиды. На рис. 1 представлены дифракционные картины от структуры смеси фос-фолипидов и сфингомиелина ФЛ1 = СФМ/ДП-ФХ/ДПФЭ с соотношением компонентов 1 : 2 : 2, измеренные в диапазоне температур 22—90°С. При 22° С на дифракционной картине четко видны четыре дифракционных пика от ламеллярной структуры с периодом повторяемости 72.2 А.
На рис. 2 представлены температурные зависимости периода повторяемости й и толщины липидного бислоя Внн, рассчитанной из функции распределения плотности длины рассеяния электронов с комбинацией знаков —, —, +, —, — для первых пяти дифракционных рефлексов. При увеличении температуры до 55°С период повторяемости уменьшается до 71.4 А, а толщина липидного бислоя постепенно сужается с 51.1 до 50.1 А. Пятый дифракционный пик появляется на
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10
q,
Рис. 1. Дифракционные спектры от структуры тройной системы ФЛ1 = СФМ/ДПФХ/ДПФЭ = 1 : 2 : 2, измеренные
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.