научная статья по теме СИНТЕЗ 4’-[3Н]-ФОСФО-ПАНТОТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕ МЕТАБОЛИЗМА В СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА Медицина и здравоохранение

НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 3, с. 211-217

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 577.164.14:612.015.6:615.356

___ __v _

СИНТЕЗ 4'-[3Н]-ФОСФО-ПАНТОТЕНОВОИ КИСЛОТЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕ МЕТАБОЛИЗМА В СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

© 2007 г. А. Г. Мойсеенок1, В. А. Гуринович1*, И. Н. Евкович1, Г. А. Бадун3, 3. А. Тясто3, М. Ю. Степаничев2, Н. А. Лазарева2, М. В. Онуфриев2, Н. В. Гуляева2

1 ГУ НПЦ Институт фармакологии и биохимии HAH Беларуси 2 Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН 3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

В работе осуществлен синтез [3Н]-фосфо-пантотеновой кислоты (ФПК) методом термической активации трития с удельной активностью 9.8 ГБк/ммоль. Исследованы распределение, транспорт и биотрансформация при интрацеребровентрикулярном введении ФПК (уни- или билатерально) самцам крыс линии Вистар в дозе 0.6 мкКи. Через 10-20 мин после введения в спинно-мозговой жидкости выявлена неизмененная ФПК, а ее поглощение структурами мозга осуществлялось с одновременной трансформацией в метаболиты, преимущественно ипсилатерально, в следующей последовательности: кора больших полушарий > гиппокамп > ствол мозга > фронтальная кора > > мозжечок. Суммарно структуры мозга удерживали до 39-42% радионуклида (10-20 мин). Через 6 ч содержание радионуклида снижалось до 17%, что не сопровождалось существенным выходом радиоактивности в систему кровообращения. Максимальный уровень [3Н]-ФПК был отмечен в гиппокампе и коре больших полушарий (37-41% общей радиоактивности). Биотрансформация радионуклида происходила по пути дефосфорилирования и биосинтеза фосфопантетеина (1220%) и СоА (1.5-5%). Предполагается возможность прямого транспорта [3Н]-ФПК через нейро-нальные мембраны и ее депонирование в ЦНС в виде предшественников биосинтеза СоА (панто-тенат, ФПК, фосфопантетеин).

Ключевые слова: 4'-фосфо-пантотеновая кислота, пантотеновая кислота, СоА, интрацеребро-вентрикулярное введение, транспорт и метаболизм в структурах мозга.

4'-фосфо-пантотеновая кислота (ФПК) - продукт первого этапа биосинтеза кофермента А (СоА) из пантотеновой кислоты (ПАК), катализируемого АТФ: Д-пантотенат-4'-фосфотрансфе-разой (пантотенаткиназой, КФ 2.7.1.33) [1, 2]. Этот фермент является ключевым в регуляции процесса биосинтеза СоА в цитозольном ком-партменте клеток эукариот, где он подвергается аллостерическому воздействию СоА-SH, ацетил-СоА, других ацил-СоА в концентрациях, близких к физиологическим. Описан механизм деингиби-рования пантотенаткиназной реакции, связанный с образованием симметричных или смешанных дисульфидов СоА [3]. Генетический дефект пан-тотенаткиназы приводит к развитию нейродеге-нерации (Pantothenate kinase-associated neurodegeneration) с доминирующим поражением экстрапирамидной системы [4].

Процесс переноса ПАК, ее метаболитов в ЦНС и биосинтез СоА изучены недостаточно, хотя ранее описаны механизмы активного транс-

* Адресат для корреспонденции: Беларусь, 230017 Гродно, БЛК-50. тел. +375 152 435671, e-mail: val@biochem.unibel.by

порта этого витамина через гематоэнцефаличе-ский барьер, поглощения из крови и аккумуляции в нервной ткани, а также биотрансформации в ФПК [5, 6]. Было констатировано отсутствие сопряженности транспорта ПАК и биосинтеза СоА в ткани головного мозга [7].

Содержание СоА-SH в больших полушариях головного мозга составляет величину от 42 до 88 нмоль/г сырой ткани [8, 9]. Это предполагает существование in situ системы биосинтеза кофермента из витаминного предшественника, L-цисте-ина и АТФ [2], в которой образование и биотрансформация ФПК играют ключевую роль. Наши недавние исследования распределения и биотрансформации ксенобиотического предшественника ПАК - Д-пантенола в отделах головного мозга свидетельствуют о быстром прохождении этим соединением гематоэнцефалического барьера и биотрансформации преимущественно до ФПК и свободной ПАК [10].

В настоящей работе поставлена цель исследования распределения и биотрансформации ФПК в структурах головного мозга при интрацеребровентрикулярном введении, что предполага-

211

2*

ет возможность поглощения предшественника СоА структурами головного мозга и его биотрансформацию до коферментных форм (4'-фосфопан-тетеин, дефосфо-СоА и СоА). Обнаружение указанных соединений возможно в форме радионуклидов. Применительно к задачам исследования нами осуществлен синтез [3Н]-ФПК и использована адаптированная к нейрохимическому исследованию технология ВЭЖХ [10]. Сложность метода синтеза ФПК и необходимость получения радионуклида с высокой удельной радиоактивностью ограничили объем эксперимента по числу использованных животных и его продолжительности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез [3Н]-ФПК. Для получения меченой тритием 4'-фосфо-пантотеновой кислоты использовали метод термической активации трития [11, 12]. Мишень готовили лиофилизацией 0.8 мл водного раствора с содержанием ФПК 0.48 мг/мл на стенках реакционного сосуда. После вакуумиро-вания сосуда его заполняли протий-тритиевой смесью с содержанием трития 33% и проводили атомизацию газа нагреванием вольфрамовой проволоки, расположенной вдоль центральной оси сосуда. В предварительных экспериментах установлено, что оптимальными с точки зрения наибольшего выхода [3Н]-ФПК и минимального количества меченых побочных продуктов являются следующие условия: давление газа 0.5 Па, температура атомизатора 1900 К, время реакции 10 с. В этом случае радиохимический выход составлял 16%. Для увеличения удельной радиоактивности [3Н]-ФПК применяли прием обновления поверхности мишени. Для этого после введения трития мишень растворяли в дистиллированной воде, снова лиофилизовали и повторяли процедуру введения трития. Лабильную метку после введения трития удаляли двукратной лиофилизацией раствора. Очистку от радиоактивных примесей проводили с помощью хроматографии на пластинках Силуфол в системе 25%-ный аммиак-во-да-изопропанол в объемном соотношении 1 : 2 : 7. Зону, соответствующую ФПК (Rf 0.15), выделяли, и вещество элюировали водой. Радиохимическая чистота выделенного препарата, определенная с помощью тонкослойной хроматографии, составляла не менее 98%. Контроль с помощью ВЭЖХ (колонка Separon SGX С18) показал присутствие в образце одного радиоактивного пика (время удерживания 4 мин, что совпадает со стандартом ФпК, детектируемым при 214 нм). В результате был получен препарат [3Н]-ФПК с удельной радиоактивностью 33 ГБк/г (100 ГБк/г при пересчете на 100%-ный тритий) или 9.8 ГБк/ммоль.

Животные и экспериментальный протокол. Эксперименты выполнены на самцах крыс линии Вистар (питомник "Столбовая", Московская обл.) массой 250-350 г, содержавшихся в условиях искусственного 12-ч светового дня при свободном доступе к воде и пище. Экспериментальный протокол утвержден Этической комиссией ИВНДиНФ РАН и соответствовал международным стандартам проведения эксперимента с животными (European Communities Council Directive (86/609/EEC)). Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата в дозе 325 мг/кг, помещали в стереотаксис и интрацеребровентрикулярно билатерально последовательно вводили по 4 мкл [3Н]-ФПК (0.6 мкКи) в латеральные желудочки мозга в соответствии с координатами стереотак-сического атласа [13]: АР —0.8 мм; L - ±1.5 мм. Иглу микрошприца опускали на глубину 3.8 мм ниже кости черепа. Скорость введения составляла 0.4 мкл/мин. Части крыс инъекцию осуществляли унилатерально с целью определения степени удерживания радионуклида в спинно-мозговой жидкости (СМЖ) и его билатеральной диффузии. Было проведено 5 вариантов введения [3Н]-ФПК: I - в правый латеральный желудочек в течение 10 мин и в течение последующих 10 мин в левый латеральный желудочек мозга; II - в правый латеральный желудочек в течение 10 мин и с обратным отбором 4 мкл СМЖ в течение последующих 10 мин; III - в правый латеральный желудочек в течение 10 мин на период 3 ч; IV - в правый и левый латеральные желудочки в течение 20 мин на период 3 ч; V - в правый и левый латеральные желудочки в течение 20 мин на период 6 ч. Дека-питацию животных осуществляли через 20 мин (I, II варианты), через 3 ч (III, IV варианты) и через 6 ч (V вариант) от начала введения радионуклида.

Подготовка материала для исследования. После декапитации мозг животных вынимали, охлаждали в изотоническом растворе NaCl и на льду выделяли фронтальную кору (ФК), кору больших полушарий (КБП, фрагмент, включавший участки париетальной, височной и окципитальной коры), гиппокамп из каждого полушария по отдельности, ствол головного мозга (СГМ) и мозжечок. Печень крыс перфузировали изотоническим раствором NaCl. Все образцы немедленно замораживали в жидком азоте. Гомогенаты ткани готовили на 4%-ной хлорной кислоте в соотношении 1 : 5 (масса : объем) и центрифугировали при 16000 g в течение 15 мин.

Кровь забирали после декапитации в пробирки, содержавшие гепарин (150 ед/мл крови) и центрифугировали 10 мин при 600 g для получения плазмы. Плазму крови депротеинизировали равным объемом 6%-ной хлорной кислоты. Хлорно-

10000 8000 6000 4000 2000 0

Плазма

А

имп мин 8000

6000

4000

2000

I

1 г-1 Печень

II

III

Б

IV

V

II

III

Группы

IV

V

имп мин 1000000 800000 600000 400000 200000 0

1 г-1 1

1 - СГМ, 2 - мозжечок

1

II III IV

Группы

V

Рис. 1. Динамика накопления [3Н]-ФПК и ее метаболитов в плазме крови (А) и в печени (Б) крыс после ее интрацеребровентрикулярного введения. Данные представлены в виде (M ± S.E.M). Здесь и на следующих рисунках по оси абсцисс группы животных (см. также в "Материалах и Методах"): I - билатеральное введение, 20 мин; II-III - унилатеральное введение, 20 мин и 3 ч соответственно; IV-V - билатеральное введение, 3 и 6 ч соответственно.

кислыи экстракт плазмы крови повторно центрифугировали, как указано выше.

Биохимический анализ ткани. Накопление радионуклида в отделах мозга, печени и крови проводили путем измерения радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Магк-2" (США). Для этого по 50 мкл полученных суперна-тантов вносили во флаконы с диоксановым сцин-тиллятором Брея [14, 15].

Исследование биотрансформации [3Н]-ФПК осуществляли методом ВЭЖХ хлорно

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.