Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, № 4, с. 464-474
УДК 577.112.6
СИНТЕЗ БИОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ХРОМОФОРОВ КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ © 2011 г. П. Е. Ивашкин, К. А. Лукьянов, И. В. Ямпольский#
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 19.11.2010 г. Принята к печати 22.11.2010 г.
Разработан метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, соответствующих хромофору зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein) c ациламиноалкильными заместителями в положении 2 имидазолона — биомиметических модельных соединений — предшественников хромофоров красных флуоресцентных белков. Метод основан на маскировке дегидро-тирозинового фрагмента целевых соединений фрагментом Р-гидрокситирозина. Ключевые стадии синтеза включают конденсацию Р-гидрокситирозина с требуемой Ж-ацетиламинокислотой, демаскировку дегидротирозина путем О-ацилирования с последующим элиминированием и циклизацию полученных производных 3-ациламинокоричной кислоты в основной среде.
Ключевые слова:хромофоры, имидазолоны, зеленый флуоресцентный белок GFP, DsRed.
ВВЕДЕНИЕ
Популярность использования зеленого флуоресцентного белка GFP и других флуоресцентных белков в качестве генетически кодируемых меток во многом определяет пристальный интерес к изучению природного разнообразия, структуры, биохимических и биофизических свойств белков данного семейства. В отличие от других белков, GFP-подоб-ные белки способны формировать хромофорную группу самостоятельно, без участия внешних кофакторов и ферментов, путем посттрансляционных модификаций собственных аминокислотных остатков. Установлено, что хромофоры белков семейства GFP имеют общее структурное ядро — 5-(4-гидроксибензилиден) -3,5-дигидро -4^-имидазол-4-он. Этот фрагмент образуется за счет циклизации, дегидратации и окисления (каждая из этих трех стадий в свою очередь делится на элементарные стадии, точная природа которых неизвестна) трех соседних аминокислот в положениях 65—67 (нумерация по белку GFP медузы Aequorea victoria) при участии молекулярного кислорода. Если дальнейших превращений не происходит, то образуется зеленый флуоресцентный белок. Однако может происходить дальнейшая модификация аминокислот-
Сокращения: AIBN — азобисизобутиронитрил; Bn — бензил; DsRed — красный флуоресцентный белок кораллового полипа Discosoma; ESI — ионизация электрораспылением; GFP — зеленый флуоресцентный белок; HOBt — Л-гидроксибензо-триазол; MALDI — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация; NBS — Л-бромсукцинимид; PMB — п-метоксибензил; TBS — трет-бутилдиметилсилил.
#Автор для связи (тел./факс: (499) 742-81-22; эл. почта: ivyamp@gmail.com).
ного остатка в положении 65, за счет чего увеличивается сопряженная система я-связей и образуется хромофор с более длинноволновым поглощением (красные, желтые, пурпурные белки). Природа и механизм этих дополнительных модификаций в настоящее время изучены очень слабо.
Ранее были разработаны методы химического синтеза модельных соединений — аналогов хромофора GFP и некоторых других флуоресцентных белков [1]. Синтез модельных хромофоров позволил получить независимые доказательства химической структуры природных хромофоров, прояснить детали их спектральных свойств и влияния на них различных факторов среды [2—5].
Настоящая работа посвящена синтезу 5-(4-гидроксибензилиден)-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, содержащих ациламиноалкильный заместитель в положении 2 имидазолона. Данные соединения являются биомиметическими предшественниками красных хромофоров и будут в дальнейшем использованы для изучения механизма окисления связи Са-М остатка в положении 65, происходящего во многих красных флуоресцентных белках и хромо-белках.
Известные методы синтеза замещенных ими-дазолонов включают: а) циклизацию производных дегидротирозина под действием оснований [6], б) взаимодействие имидатов [7, 8] и амидинов [9] с подходящими 1,2-динуклеофилами, в) циклизацию а-азидоимидов под действием трифе-нилфосфина [10], г) кросс-сочетание бороновых кислот с тиоимидазолонами [11].
Необходимость введения а-ациламиногруппы в положение 2 имидазолона существенно ограничивает набор доступных синтетических методов. Методы в) и г) в данном случае неприменимы из-за отсутствия подходов к синтезу соответствующих а-ациламинозамещенных имидов и бороно-вых кислот. Жесткие условия получения имино-эфиров и амидинов (метод б) совместимы лишь с наиболее инертными аминокислотными остатка-
465
ми, кроме того, циклизация алкилзамещенных амидинов характеризуется крайне низкими выходами (<10%) [7]. На основании вышеизложенного было решено использовать циклизацию производных дегидротирозина (метод а) в качестве ключевой стадии сборки имидазолонового ядра. Далее обсуждаются четыре последовательные попытки синтеза целевых соединений (схема 1).
Zotbs
OH
4s
O'
N \
X = Br, N3
R O
'N Y
м
NR \
Y = O, NAlk
OBn
HO
NH
O HN-
2 н
CO2Me HO R
O
Путь 1
OH
O^
'N \
Путь 4
Путь 2
O
R
Путь 3
OBn
W
-N N-
i
ХИ,
OBn
O
O O^O R W = H, MeO(C6H4)
NH2
2 H
CO2Me HO R
O HN—^ O
Схема 1. Четыре обсуждаемых подхода к синтезу 3-метил-2-(а-ацетиламино)алкил-5-арилиден-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-онов: функционализация а-положения гетероцикла (1); сборка гетероциклического ядра с использованием оксазолов (2), дегидротирозина (3), гидрокситирозина (4).
OH
O'
N \
1. TBSCl
'Pr2NEt
2. NBS ' AlBN
OTBS
O
NaN3
Br
N \
(I)
w NH3, BnNH2, ^N Bn2NH
OTBS
O
N3
N \
(II)
V/ PPh3(AcOH), 'N Zn, Na/Hg
Схема 2. Функционализация a-положения 2,3-диметил-5-арилиден-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ лов, в том числе имидазолонов, является функцио-
Синтетический подход № 1. Наиболее очевид- нализация а-положения гетероцикла. Ранее в на-ным подходом к синтезу а-замещенных гетероцик- шей лаборатории был разработан метод синтеза
а-кето- [3] и а-алкилимино-имидазолонов [5]. Однако многочисленные попытки восстановления двойной связи С=М и синтеза а-ацилиминопроиз-водных на основе полученных соединений не увенчались успехом. В рамках данной работы был успешно осуществлен синтез О-силилированного 2-бромметилимидазолона (I) (схема 2), однако в ходе дальнейшего взаимодействия с аминами, аммиаком и ацетамидом наблюдалась полная деградация имидазолонового цикла. 2-Азидометилимидазолон (II) также не удалось превратить в аминопроизвод-ные при восстановлении трифенилфосфином (вероятно, из-за высокой нуклеофильности промежуточного илида) и другими восстановителями.
Синтетический подход № 2. Наиболее универсальный путь сборки de novo гетероциклического ядра 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов предполагает использование 4-арилиден-4,5-дигидрооксазол-5-онов (III) (схема 3). Соединения (III) доступны путем азлактонизации соответствующих ^-ацилглицинов и последующей конденсации с 4-гидроксибензальдегидом [3, 12, 13]. Несмотря на многочисленные попытки конденсации а-ациламинозамещенных азлак-тонов с альдегидами в условиях основного либо кислотного катализа, нам не удалось получить целевые оксазолоны типа (III). Основным процессом в случае ^-ацетилфенилаланина (IV) является перегруппировка [14] насыщенного азлактона (V) в ^-ацетилдикетопиперазин (VI) (схема 3).
OAc
O
(III)
R, R' = Alk, Ar
O.
OH
O
1. GlyOEt, HO2C. .NH DCC
N^^-^R Основание
O
NH
I
R'
O
O
T
Bn (IV)
2. NaOH
HO2C N
H
OH
O
NH dcc
N
y-R
N
R'
OAc
Bn
или _
Ac2O O^O
OAc
O
O
-N HN—{
г ^ V
-O Bn (IIIa)
H
N^ ^O
Bn
Основание
XX
O^N^Bn
(V)
O
А
(VI)
Схема 3. Общая стратегия синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-онов на основе оксазолонов (III). Синтез с использованием Л-ацетилфенилаланина.
А
Проблема исключения перегруппировки на стадии конденсации может быть решена введением защитной группы по амидному атому азота ацетиламинокислоты. В качестве защитной группы была выбрана 4-метоксибензильная группа, обеспечивающая достаточную гибкость в выборе условий депротекции (восстановление, окисление, ацидолиз). Соответствующий ^-РЫБ-^-ацетилфенилаланин (VII) был успешно получен и превращен в имидазолон (VIII) с остатком ^-защищенного фенилаланина (схема 4).
В ходе дальнейших экспериментов было обнаружено, что пара-метоксибензильная группа в соединении (VIII) не может быть селективно удалена при каталитическом гидрировании, восстановле-
нии металлами и другими реагентами. Одновременно со снятием защиты происходит гидрирование двойной С=С-связи имидазолонового ядра. Реокисление дигидроимидазолона по описанной методике [15] проходит с очень низким выходом и не может считаться препаративной реакцией. Окислительная депротекция РЫБ-амида (VIII) под действием нитрата аммония-церия приводит к деградации имидазолонового ядра, в том числе при наличии защитной метильной группы на атоме кислорода фенольного фрагмента.
Как известно, метоксибензильная группа в ряде случаев может быть удалена действием сильных кислот (в том числе в присутствии перехватывающих нуклеофилов: тиоанизола, пентаме-
тилбензола и т.п.). В нашем случае ацидолиз метоксибензиламидного фрагмента происходил только под действием такой сильной кислоты, как трифторметансульфокислота в слабоосновном растворителе (например, в дихлорметане) с низким выходом (<20%). При добавлении нук-леофилов выход целевого продукта снижался до
5% и менее. Неожиданно жесткие условия удаления защитной группы оказались несовместимыми с другими аминокислотными остатками (ала-нин, глицин). Под действием трифторметансуль-фокислоты из соответствующих защищенных хромофоров образуется сложная смесь продуктов деградации.
ОМе
1.
НО2С КН2 о'"
| 2. №БН4
Вп
Н
НО2С^
^рмб
Вп
Ле2О, №ОН
ОН
О.
Г
О
1. GlyOEt, БСС
НОп^ ^^^ 2 ШОН "
2 РМБ 2 МаОН НО2С N
Вп Н Вп
N.
'РМБ
ОЛс
1. ББС, NEt3
О
2. МеШН2
3. С82СО3, DMF
РМ\ О N (
(VII)
Схема 4. Синтез РМВ-защищенного хромофора (VIII).
О^ ^ Вп (VIII)
Синтетический подход № 3. Один из альтернативных подходов к синтезу производных дегидротиро-зина
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.