ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 446, № 6, с. 696-699
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 577.175.82
СИНТЕЗ ДОФАМИНА НЕДОФАМИНЕРГИЧЕСКИМИ НЕЙРОНАМИ МЕДИОБАЗАЛЬНОГО ГИПОТАЛАМУСА ВЗРОСЛЫХ КРЫС
© 2012 г. В. И. Мельникова, Ю. В. Люпина, А. В. Лаврентьева, А. Я. Сапронова,
академик М. В. Угрюмов
Поступило 19.07.2012 г.
Многие годы считалось, что один из наиболее важных и широко распространенных нейро-трансмиттеров — дофамин (ДА) синтезируется только в ДА-ергических (биферментных) нейронах. Эти нейроны обладают двумя ферментами — тирозингидроксилазой (ТГ), превращающей Z-тирозин в Z-диоксифенилаланин (Z-ДОФА), и декарбоксилазой ароматических Z-аминокислот (ДАА), превращающей Z-ДОФА в ДА [1-3]. Однако в середине 1980-х годов с появлением метода двойного иммуноцитохимического мечения [3] в различных отделах мозга многих видов млекопитающих помимо биферментных нейронов были обнаружены моноферментные нейроны, экс-прессирующие по одному из ферментов синтеза ДА-ТГ или ДАА [4-8]. По числу и распространенности в пределах мозга моноферментные нейроны превосходят ДА-ергические нейроны, что косвенно свидетельствует об их широкой вовлеченности в функционирование мозга.
Наиболее хорошо изучены моноферментные нейроны в медиобазальном гипоталамусе, включающем аркуатное ядро, в котором расположены тела ДА-продуцирующих нейронов, и срединное возвышение, в которое проецируются аксоны этих нейронов. В медиобазальном гипоталамусе взрослых животных моноферментные нейроны составляют около 50% от общего числа нейронов, экс-прессирующих ферменты синтеза ДА [8]. В аркуат-ном ядре плодов крыс в конце пренатального периода развития доля моноферментных нейронов составляет более 99% и лишь менее 1% ДА-ер-гических нейронов [8, 10]. Тем не менее в экспериментах ex vivo и в диссоциированной культуре клеток было показано, что нейроны аркуатного ядра плодов крыс синтезируют ДА и выделяют его в количестве, достаточном для обеспечения инги-
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина Российской академии медицинских наук, Москва
бирующего контроля секреции пролактина гипофизом [11, 12].
Изложенные выше данные позволили нам предположить участие моноферментных нейронов, содержащих комплементарные ферменты синтеза ДА, в совместном синтезе этого нейро-трансмиттера [13]. В ходе проверки нашего предположения получены прямые доказательства кооперативного синтеза ДА в нейронах медиоба-зального гипоталамуса, однако только у плодов крыс при количественном доминировании моноферментных нейронов [14]. При этом вопрос о возможном синтезе ДА моноферментными нейронами взрослых животных оставался открытым.
Цель настоящей работы — проверка нашей гипотезы о том, что ДА синтезируется моноферментными (неДА-ергическими) нейронами не только на ранних этапах онтогенеза, но и у взрослых животных.
Работа проведена на 30 крысах-самцах линии Вистар массой 200—300 г. Животных наркотизировали пентобарбиталом (40 мг/кг), после чего декапитировали и выделяли мозг. Готовили виб-ратомные срезы мозга толщиной 300 мкм в растворе Кребса—Рингера следующего состава (мМ): NaCl 120, KCl 4.8, CaCl2 2.0, MgSO4 1.2, NaHCO3 25, .D-глюкоза 10.1, HEPES 20 и аскорбиновая кислота 0.13 (pH 7.4) при температуре 4°С. Далее из полученных срезов вырезали медиобазальный гипоталамус, включающий аркуатное ядро и срединное возвышение. В качестве контроля использовали черную субстанцию, в которой практически отсутствуют моноферментные нейроны.
Срезы описанных выше отделов мозга использовали для статичной и проточной инкубации. Для статичной инкубации срезы помещали во флаконы с 1 мл раствора Кребса—Рингера и при 37°С и "мягком" встряхивании проводили 30-минутную преинкубацию (стабилизация), после которой среду не собирали. Затем раствор Кребса-Рин-гера меняли на новый и инкубировали еще 30 мин, после чего переносили в раствор Кребса-Ринге-ра, содержащий 0.5 мМ Z-лейцин. В собранные после двух 30-минутных инкубаций образцы среды добавляли 1 N HClO4 до конечной концентра-
СИНТЕЗ ДОФАМИНА
697
ции 0.1 N, а также 1 нг диоксибензиламина (ДГБА) в качестве внутреннего стандарта в 10 мкл 0.1 N HClO4, замораживали и хранили при —70°C до определения содержания ДА и метаболитов. Срезы после статичной инкубации гомогенизировали при помощи ультразвукового гомогенизатора в 500 мкл 0.1 N HClO4, содержащего 1 нг ДГБА, и центрифугировали 20 мин при 15 000 об/мин. Супернатант собирали, замораживали и хранили при —70°C до измерения ДА и его метаболитов. Для проточной инкубации срезы помещали в термостатируемые (37°C) камеры объемом 400 мкл. Постоянную скорость протока раствора через камеры (100 мкл/мин) обеспечивали перистальтическим насосом ("Rabbit Raining", Франция). Часть камер перфузировали раствором Кребса—Рингера, другую часть — раствором Креб-са—Рингера с 0.5 мМ Z-лейцином. В период стабилизации системы в течение 40 мин пробы не собирали, после чего последовательно собирали 6 десятиминутных фракций оттекающего раствора. В каждую собранную фракцию добавляли одну десятую объема 1N HClO4 до конечной концентрации 0.1 N, а также 1 нг ДГБА в 10 мкл 0.1 NHClO4 и хранили при температуре —70°C до определения содержания ДА и метаболитов. Срезы после проточной инкубации обрабатывали и хранили так же, как после статичной инкубации.
Для определения ДА и метаболитов в ткани и инкубационной среде использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭ-ЖХ) с электрохимической детекцией (ЭД) (Amper-ometric detector LC-4B, "Bioanalytical Systems", США). ДА и метаболиты предварительно экстрагировали на оксиде алюминия и элюировали 100 мкл 0.2 N HClO4, после чего разделяли на обратно-фазной 15-сантиметровой колонке с внутренним диаметром 3 мм и наполнителем нуклеосил С-18.5 мкм ("Элсико", Россия) при потенциале 850 мВ. Пробы вводили в инжектор ("Raininn", США) с петлей объемом 50 мкл. Подвижной фазой служил 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0.3 ммоль октансульфоната натрия ("Sigma"), 0.1 ммоль ЭДТА ("Sigma") и 12% аце-тонитрила ("Sigma") (pH 3.1). Скорость потока 800 мкл/мин обеспечивалась насосом Gilson 10SC (Франция). Пики ДА и метаболитов идентифицировали по времени выхода веществ в стандартном растворе. Содержание моноаминов и метаболитов рассчитывали методом внутреннего стандарта, используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце, с помощью программного обеспечения Мультихром (Россия).
Суммарную концентрацию ДА и метаболитов (ткань после инкубации + среда) определяли по формуле
С1+С 2
K =
M
где С1 — содержание ДА и метаболитов в среде (нг), С2 — содержание ДА и метаболитов в ткани (нг), М — масса срезов (мг).
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью непараметрического критерия Уилкоксона.
Данное исследование было предпринято для проверки нашей гипотезы, согласно которой у взрослых млекопитающих моноферментные нейроны, составляющие 50% от всех нейронов ме-диобазального гипоталамуса, экспрессирующих ферменты синтеза ДА [8], совместно синтезируют ДА. Это означает, что ¿-ДОФА, синтезирующийся из ¿-тирозина в моноферментных ТГ-нейро-нах, выделяется во внеклеточную среду и захватывается оттуда в моноферментные ДАА-нейро-ны, где осуществляется синтез ДА [7, 14]. Если наша гипотеза о кооперативном синтезе ДА моноферментными нейронами мозга взрослых животных верна, то ингибирование поступления ¿-ДОФА в моноферментные ДАА-нейроны ме-диобазального гипоталамуса должно привести к снижению в них синтеза ДА и не повлиять при этом на синтез ДА в ДА-ергических (бифермент-ных) нейронах черной субстанции, в которой отсутствуют моноферменные нейроны. В качестве конкурентных ингибиторов поступления ¿-ДО-ФА в моноферментные ДАА-нейроны могут быть использованы крупные нейтральные аминокислоты, такие как ¿-лейцин, ¿-тирозин ¿-метио-нин и др., которые конкурируют за один и тот же мембранный переносчик [15].
Для доказательства нашей гипотезы использован принципиально такой же методический подход, как и для доказательств кооперативного синтеза ДА нейронами аркуатного ядра у плодов крыс [14], однако с некоторыми модификациями. Мы проводили сравнительный анализ синтеза ДА при инкубации срезов медиобазального гипоталамуса в Кребс-Рингер-буфере и при добавлении крупной нейтральной аминокислоты — ¿-лейци-на, а не ¿-тирозина, который использовали на плодах. ¿-лейцин в отличие от ¿- тирозина не является субстратом ТГ и не должен изменять синтез ДА в биферментных нейронах. В медиобазаль-ном гипоталамусе плодов биферментные нейроны практически отсутствуют, поэтому влияние ¿-тирозина на синтез ДА в них мы могли полностью исключить. Однако у взрослых животных только половина ДА-продуцирующих нейронов этой области мозга являются моноферментными, а в остальных — ДА-ергических — ¿-тирозин будет усиливать синтез ДА, что в результате может нивелировать ингибирующий эффект ¿-тирози-на на перенос ¿-ДОФА и синтез ДА в моноферментных ДАА-нейронах. Поэтому мы и выбрали ¿-лейцин, который не является предшественником ¿-ДОФА. Кроме того, вместо клеточной суспензии медиобазального гипоталамуса плодов в
698
МЕЛЬНИКОВА и др.
(а)
нг/мг 10
□ КРБ ■ КРБ + лейцин 0.5 мМ
Х-ДОФА
ДА ДОФУК
нг/мг 8 г
6 -
(б)
0.8 0.6 0.4 0.2
0
нг/мг 0.8
нг/мг 20
15
10
5 -
(а)
□ КРБ ■ КРБ + лейцин 0.5 мМ| нг/мг
т 4
- 2
Х-ДОФА
нг/мг 16
12
ДА
ДОФУК
нг/мг 4
- 1
Х-ДОФА
ДА ДОФУК
Х-ДОФА
ДА ДОФУК
Рис. 1. Суммарная концентрация Х-диоксифенил-аланина (Х-ДОФА) — левая ось ординат, дофамина (ДА) и дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) — правая ось ординат, в среде и ткани после статичной инкубации срезов медиобазального гипоталамуса (а) и черной субстанции (б) в Кребс—Рингер-буфере (КРБ) — контроль или в Кребс—Рингер-буфере с Х-лейцином (КРБ + Х-лейцин) — опыт. Звездочка — достоверные различия между контрольной и опытной группами (Р < 0.05).
Рис. 2. Суммарная концентрация Х-диоксифенилала-нина (Х-ДОФА) — левая ось ординат, дофамина (ДА) и дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) — правая ось ординат, в среде и ткани после п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.