ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 1, с. 33-37
УДК 577.152.192.3
СИНТЕЗ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩЕГО ПОЛИАНИЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛАККАЗЫ
© 2009 г. И. С. Васильева, О. В. Морозова, Г. П. Шумакович, А. И. Ярополов
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071; e-mail: yaropolov@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 14.02.2008 г.
Предложен новый метод синтеза электропроводящего комплекса полианилина (ПАНИ) и поли(2-ак-риламидо-2-метил-1-пропансульфокислоты, ПАМПС) с использованием в реакции окислительной полимеризации анилина иммобилизованной лакказы из базидиального гриба Trametes hirsuta в качестве биокатализатора. Оптимизированы условия иммобилизации лакказы на КМ-целлюлозе бифункциональным реагентом Вудворда. Проведено сравнение каталитических свойств иммобилизованной и нативной лакказ. Иммобилизованная лакказа являлась эффективным катализатором окислительной радикальной полимеризации анилина на матрице полисульфокислоты при 4°С. Показано, что иммобилизованный фермент может использоваться неоднократно при проведении ферментативного синтеза полимера. Исследованы некоторые спектральные характеристики ПАНИ/ПАМПС-ком-плексов, синтезированных при различных значениях рН раствора. Электропроводимость образцов ПАНИ, полученных с использованием в качестве катализатора иммобилизованной лакказы, составляла 13 мСм/см.
Полианилин (ПАНИ) является одним из наиболее важных электропроводящих полимеров в силу своей высокой химической стабильности, простоты получения, относительно высокой электропроводимости и способности изменять физико-химические свойства при различных физических воздействиях (рН, электрическое поле). В последние годы резко возрос интерес к изучению этого полимера в связи с возможностью его широкого практического использования в аккумуляторах, химических сенсорах, антикоррозионных покрытиях, для электромагнитной защиты, для создания электрохромных и электронных устройств [1-4]. Обычно электропроводящий ПАНИ синтезируют химическим методом в сильно кислой среде путем окислительной полимеризации мономера. Как правило, в качестве окислителя (инициатора реакции) используют персульфат аммония в количествах, эквивалентных концентрации мономера. Реакция является экзотермической и кинетически неконтролируемой, в результате чего синтез ПАНИ проводят при температуре близкой к 0°С [5]. При этом получается нерастворимый полимер с широким распределением по молекулярным массам. Использование ферментов в синтезе ПАНИ позволяет проводить процесс в экологически чистых и мягких условиях, с высокой степенью контроля скорости инициирования полимеризации и получать полимер, не загрязненный продуктами разложения окислителя. В работе [6], в качестве катализатора реакции окислительной полимеризации анилина использовали гомогенный высокоочищенный препарат лакказы Т. hirsuta. Вторым субстратом этого фермента является
молекулярный кислород, который в процессе каталитической реакции восстанавливается по четы-рехэлектронному механизму непосредственно до воды. Однако использование нативного фермента для синтеза ПАНИ имеет ряд недостатков. Лакказа может включаться в полученный полиэлектролитный комплекс, а также, невозможно повторное использование фермента. Для решения этих проблем можно использовать иммобилизованную лакказу. Иммобилизация в некоторых случаях защищает фермент от денатурации, расширяет температурный и рН диапазон реакции, облегчает отделение фермента от реакционной среды, что позволяет использовать его в нескольких циклах реакции [7].
Выбор метода иммобилизации и типа носителя определяется спецификой фермента и решаемыми задачами [8]. В настоящей работе в качестве матрицы для получения гетерогенного препарата лакказы использовали КМ-целлюлозу, а в качестве сшивающего агента - бифункциональный реагент Вудворда (рис. 1).
C2H5
SO3
Рис. 1. Структурная формула реагента Вудворда (2-этил-5-фенилизоксазолин-3'-сульфонат).
Цель работы - проведение синтеза электропроводящего интерполимерного комплекса ПАНИ/ПАМПС (поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфокислота) с использованием иммобилизованной лакказы Т. hirsuta и исследование возможности многократного использования биокатализатора.
МЕТОДИКА
Лакказа была получена из культуральной жидкости базидиального гриба Т. hirsuta согласно методу [9].
Иммобилизацию лакказы проводили на КМ-цел-люлозе [10]. 300 мг КМ-целлюлозы и 15 мг реагента Вудворда перемешивали в 5 мл деонизиро-ванной воды при 4°С в течение 1 ч. Смесь центрифугировали (8000 g, 10 мин), ресуспендировали в 5 мл воды и добавляли 50 мкл лакказы (0.05 мг/мл). Смесь перемешивали 24 ч при 4°С, осадок отделяли центрифугированием (8000 g, 10 мин), дважды промывали бидистиллированной водой, а затем 0.05 М Na-цитратно-фосфатным буфером, рН 3.5. Иммобилизованную на КМ-целлю-лозе лакказу использовали для синтеза ПАНИ.
Активность иммобилизованной лакказы определяли, используя в качестве субстрата 0.01 М раствор пирокатехина (к = 410 нм; £ = 740 М-1 см-1) в 0.1 М Na-цитратно-фосфатном буфере, рН 4.5 [11].
Ферментативный синтез полиэлектролитного комплекса ПАНИ/ПАМПС проводили при 4°С в 0.05 М Na-цитратно-фосфатном буфере, рН 3.5. Концентрации анилина и ПАМПС (рассчитанная на повторяющееся звено полимера) в реакционной смеси были 25 мМ. Реакцию инициировали добавлением 0.5 мг иммобилизованной лакказы.
Полимеризацию проводили при постоянном перемешивании в течение 24 ч при 4°С. Затем надо-садочную жидкость отделяли центрифугированием (12000 g, 10 мин). Осадок иммобилизованного фермента многократно промывали водой и использовали в дальнейших синтезах. Синтез комплекса ПАНИ/ПАМПС с использованием натив-ного фермента проводили аналогичным образом, инициируя реакцию полимеризации добавлением 20 мкл лакказы (4 х 10-7 М).
Измерения электропроводимости пленочных образцов проводили на ситалловых подложках с предварительно нанесенными золотыми контактами. 20 мкл комплекса ПАНИ/ПАМПС наносили на подложку и сушили на воздухе. Межконтактный зазор составил 1 мм. Толщина пленок ПАНИ, измеренная на профилометре Talystep ("Taylor Hobson", Великобритания), была 10-40 мкм. Электропроводимость измеряли в двухточечной схеме при постоянном напряжении. Напряжение 1 В задавалось источником Б5-49 (Россия), величина тока фиксировалась амперметром В7-40А (Россия).
Таблица 1. Влияние количества реагента Вудворда на иммобилизацию лакказы*
Реагент Вудворда, мг Активность фермента после иммобилизации по отношению к исходной, % Количество белка, связанного с КМ-целлюлозой, мг белка/г сорбента
5 86 1.1
15 90 1.3
35 80 1.1
45 65 0.9
70 54 0.7
* Количество КМ-целлюлозы во всех экспериментах - 300 мг.
Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометрах Hitachi-557 и Shi-madzu UV mini-1240 (Япония).
В работе использовали следующие реактивы: карбоксиметил-целлюлоза Сервацел КМ 23 ("Reanal", Венгрия); 2-этил-5-фенилизоксазолин-3'-суль-фонат (реагент Вудворда), пирокатехин, ПАМПС ("Aldrich", США); лимонная кислота ("ICN", Великобритания); Na2HPO4 ■ H2O ("Merck", Германия); H3PO4, NaOH, H3BO3 и СН3СООН - отечественные препараты марки "ос.ч.". В работе использовали дважды очищенный вакуумной дистилляцией анилин фирмы "ХимМед" (Россия). Все растворы готовили с использованием воды, очищенной на установке Simplicity ("Millipore", США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для получения гетерогенного препарата лакказы, с целью его последующего использования для синтеза водорастворимого электропроводящего интерполимерного комплекса ПАНИ/ПАМПС, были оптимизированы условия иммобилизации фермента на водонерастворимой матрице и определена pH- стабильность полученного гетерогенного биокатализатора.
Иммобилизация лакказы. Гомогенный препарат лакказы Т. hirsuta (КФ 1.10.3.2) иммобилизовали на КМ-целлюлозе с использованием реагента Вудворда (рис.1), который, являясь изоксазолиевой солью, взаимодействует с карбоксильными группами КМ-целлюлозы, в результате чего образуются сложные эфиры енолов. Последние, в свою очередь, реагируют с аминогруппами фермента [10].
В табл. 1 приведены данные по иммобилизации лакказы Т. hirsuta, полученные при различных соотношениях реагентов. Активность иммобилизованного фермента падала при увеличении концентрации реагента Вудворда, что, возможно, обусловлено изменением третичной структуры белка за счет многочисленных внутримолекулярных сши-
Рис. 2. Стабильность нативной (1-3) и иммобилизованной (Г-3') лакказ при различных значениях рН раствора: 1, 1' - 2.0, 2, 2' - 3.0, 3, 3' - 6.0. Условия: 0.1 М Ка-цитратно-фосфатный буфер, 4°С.
Рис. 3. Электронные спектры полиэлектролитного комплекса ПАНИ/ПАМПС, полученные с использованием иммобилизованной лакказы: 1 - первое использование фермента; 2 - повторное использование фермента.
вок фермента бифункциональным реагентом. Было найдено оптимальное соотношения реагента Вудворда и КМ-целлюлозы - 15/300 мг, при котором сохранялась максимальная активность иммобилизованной лакказы.
Влияние рН на стабильность фермента. Была исследована рН стабильность иммобилизованной и нативной лакказ при различных значениях рН раствора (рис. 2). Стабильность, как иммобилизованного, так и нативного фермента возрастала с увеличением значения рН раствора. Использованная в работе лакказа, из базидиального гриба Т. hirsuta, является кислотостабильным ферментом. При этом стабильность иммобилизованной лакказы была несколько выше стабильности нативного фермента. При наиболее оптимальном для получения электропроводящего ПАНИ значении рН, равном 3.5, иммобилизованная лакказа сохраняла ~45% своей первоначальной активности после инкубации при 4°С в течение 4 сут.
Были рассчитаны константы инактивации (кин) первого порядка для иммобилизованной и нативной лакказ при различных значениях рН раствора (табл. 2). Как видно из табл. 2, с увеличением рН раствора нативная лакказа инактивируется быстрее, чем иммобилизованная.
Спектральные характеристики ПАНИ, синтезированного с использованием иммобилизованной лакказы. В результате ферментативного синтеза с участием иммобилизованной лакказы образуется
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.