rm,« БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2013, том 39, № 3, с. 255-276
ш
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.112.854:577.344:547.782538.14.057
СИНТЕЗ ХРОМОФОРОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ И ИХ АНАЛОГОВ
© 2013 г. М. С. Баранов, К. А. Лукьянов, И. В. Ямпольский#
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 19.09.2012 г. Принята к печати 02.11.2012 г.
Белки семейства зеленого флуоресцентного белка (GFP, Green Fluorescent Protein) широко применяются в экспериментальной биологии в качестве генетически кодируемых флуоресцентных маркеров. Хромофоры GFP-подобных белков имеют общее структурное ядро — 3,5-дигидро-4#-ими-дазол-4-он. Настоящий обзор посвящен методам синтеза его производных, замещенных по различным положениям. Рассмотрены как наиболее универсальные и широко используемые методы, так и необычные, подтвержденные единичными примерами. Наиболее распространенный метод синтеза замещенных 3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов включает получение азлактонов, затем из них Ж-ацилдегидроаминокислот, и наконец, циклизацию последних с образованием целевых гетероциклических соединений. Соответственно, обзор состоит из трех разделов: 1) синтез азлактонов, 2) основные пути синтеза производных Ж-ацилдегидроаминокислот, 3) методы циклизации амидов Ж-ацилдегидроаминокислот и все прочие синтезы 3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов.
Ключевые слова: флуоресцентный белок, хромофор, GFP, азлактон, имидазолон.
DOI: 10.7868/S0132342313030044
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
1. Синтез оксазолонов
1.1. Конденсация карбонильных соединений с производными ^-ацилглицина
1.2. Прочие методы синтеза оксазолонов
2. Синтез производных ^-ацилдегидроамино-кислот
2.1. Нуклеофильное раскрытие оксазолонов
2.2. Прочие методы синтеза амидов ^-ацилде-гидроаминокислот
3. Методы синтеза имидазолонов
Сокращения: Ar — арил; CDI — карбонилдиимидазол; DABCO — 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан; DBU — диазаби-циклоундецен; DDQ — 2,3-дихлор-5,6-дициан-1,4-бензо-хинон; DEAD — диэтилазодикарбоксилат; имидазолон — 5-арилиден-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-он; DIPEA — ди-изопропилэтиламин; GFP — зеленый флуоресцентный белок; HOBt — 1-гидроксибензотриазол; LDA — дизопропи-ламид лития; MS — молекулярные сита; оксазолон — 5-ари-лиден-3,5-дигидро-4Н-оксазол-4-он; NBS — N-бром-сукцинимид; PMB — п-метоксибензил; Py — пиридин; TBDMS — трет-бутилдиметилсилил; Ts — тозил; ФБ — флуоресцентный белок.
# Автор для связи (+7 (499) 724-81-22; факс: +7 (495) 330-7056; эл. почта: ivyamp@ibch.ru).
3.1. Циклизация амидов М-ацилдегидроами-нокислот
3.2. Прочие методы синтеза имидазолонов
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время различные белки семейства зеленого флуоресцентного белка (ОБР) находят все большее применение в экспериментальной биологии в качестве генетически кодируемых флуоресцентных маркеров [1].
В отличие от других природных пигментов, чей биосинтез требует участия множества ферментов и кофакторов, формирование хромофора ОБР происходит за счет посттрансляционной модификации собственных аминокислотных остатков. Образование хромофора катализируется самим белком и не требует участия каких-либо сторонних агентов за исключением молекулярного кислорода. Установлено, что хромофоры всех природных белков семейства ОБР имеют общее структурное ядро — 5-(4-гидроксибензилиден)-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-он (схема 1). Данный фрагмент
образуется за счет циклизации, дегидратации и окисления трех соседних аминокислотных остатков в положениях 65—67 (нумерация по белку GFP медузы Aequorea victoria) при участии молекулярного кислорода; каждый из этих трех этапов в свою очередь делится на элементарные стадии, точная природа которых еще не установлена. В отсутствие дальнейших превращений образуется простейший
зеленый хромофор, — непосредственный предшественник многих родственных структур. Последние образуются в ходе модификации аминокислотного остатка в положении 65, при этом за счет увеличения сопряженной системы я-связей происходит образование хромофоров с более длинноволновой флуоресценцией (желтые, красные, пурпурные белки) [1—3] (схема 2).
OH OH OH
GFP(510) DsRed(585) AsFP(595)
Kaede(582) zFP(538) Kusabira 0range(560)
Схема 2. Различные типы хромофоров с длинноволновым поглощением (в скобках указаны максимумы испускания в нанометрах).
С помощью направленного мутагенеза также могут быть получены различные аналоги флуоресцентных белков, содержащие модифицированный хромофор. Было показано, что при заме-
не Туг66 в ОБР на другие ароматические аминокислоты образуются флуоресцентные белки с гипсохромным сдвигом [4]. В частности, голубой и синий мутанты ОБР содержат остатки Тгр66 и
His66 соответственно, а наибольший гипсохром-ный сдвиг наблюдался при замене остатка Tyr66 на Phe в белке Sirius [5].
Механизмы биосинтеза, физические и химические свойства хромофоров ФБ являются объектом пристального внимания исследователей. Для изучения указанных вопросов были привлечены самые разнообразные подходы, такие как рентге-ноструктурный анализ, генная инженерия, изучение продуктов гидролиза ФБ, флуоресцентная спектроскопия, а также многие другие [1, 3—14]. Среди прочих методов отдельное место занимает синтез модельных соединений. Данный подход позволяет получить независимые доказательства химической структуры природных хромофоров, прояснить детали их спектральных свойств, а также влияние на них различных факторов среды [15—18]. Также модельный синтез позволил сотрудникам нашей лаборатории установить подробности механизма биосинтеза хромофоров красных ФБ типа DsRed [19].
В связи с этим, синтез производных 5-(бензи-лиден)-3,5-дигидро-4^-имидазол-4-она является важной практической задачей. Мы поставили
цель в настоящем обзоре наиболее полно рассмотреть все синтетические пути, позволяющие получить подобные структуры.
Основным из данных подходов является циклизация амидов ^-ацилдегидроаминокислот, которые в свою очередь, наиболее часто синтезируются путем аминолиза оксоаналогов имидазолонов — 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-оксазол-4-онов (ок-сазолонов) (схема 3).Производные как оксазоло-нов, так и ^-ацилдегидроаминокислот служат основой для множества биологически активных соединений, а также различных гетероциклических систем, поэтому их химия достаточно хорошо проработана. В связи с этим, первые два раздела данного обзора будут посвящены различным методам получения этих производных. В последнем разделе мы рассмотрим методы циклизации амидов N-ацилдегидроаминокислот, а также все прочие методы синтеза имидазолонов. Следует отметить, что хромофоры ФБ не содержат в своей структуре гете-роатомных заместителей в положениях R1, R2 и R3, поэтому мы не будем рассматривать соответствующие производные в данном обзоре.
R3
R2
N
"ч 1 r4nh2 3 \—R1 -► R3
O
f-O
2O^ .R R2 4х
NH
O" NH
4
-H2O
R3
R2
N
^—R1
O R4
Схема 3. Наиболее часто используемый метод синтеза имидазолонов.
1. СИНТЕЗ ОКСАЗОЛОНОВ
Существует целый ряд подходов, позволяющих получить производные оксазолонов [20], наиболее распространенный — конденсация карбонильных соединений с циклическими производными ^ацилглицина.
1.1. Конденсация карбонильных соединений с производными ^ацилглицина
Чаще всего оксазолоны получают синтезом Эрленмейера [21] (схема 4).
R2
NHCOR R\^O AcONa 3 N
| + Т3 ^c^ R ^—R1
COOH R3
Схема 4. Реакция Эрленмейера.
Процесс представляет собой циклизацию ^ацилглицина с последующим присоединением карбонильного соединения. Оригинальная методика не предполагала разделения этих стадий, а в роли как конденсирующего, так и дегидратирующего агента использовалась смесь ацетата натрия
с уксусным ангидридом. Подобная реакция, очевидно, осложнялась побочными процессами, такими как реакция Перкина [22], а также переаци-лированием глицина, в результате которого вместо искомого соединения образуется его аналог, где R1 = Ме (схема 5).
Таблица 1. Реагенты и конденсирующие агенты, применяемые в синтезе оксазолонов по Эрленмейеру (см. схему 4)
R2 R3 Конденсирующий агент Выход, % Ссылка
СН3 2-М02-С6Щ Н Лс20/Лс0№ 63 24-26
РЬ СБ3СН3СН Н 7п(0Лс)2 99+ 30
РЬ СН3С0 СН3 РЬ(0Лс)2/Лс20 36 29
РЬ РЬСО СН3 РЬ(0Лс)2/Лс20 86 29
РЬ 4-0Н—С6Н4 Н КР"/Л1203-Лс20 90 34
РЬ 5-нитротиен-2-ил Н Ионообменная смола 62 35
РЬ 5-нитрофур-2-ил Н Ионообменная смола 77 35
РЬ РЬ Н Цеолит 80 36
СН3 РЬ Н Цеолит 73 36
АеСШ
\ Ле2о' [
Н °Н
Я2
КНСОЯ1 ЛС20 .КНСОСНз R2R3cо „зА^К
I -- Г я у У-СНз
СООН СООН ЛсОМа /--О
Схема 5. Побочные процессы, осложняющие реакцию Эрленмейера.
Существенным ограничением для этой реакции является активность карбонильных соединений. Так, оригинальная работа предполагала использование лишь альдегидов, а первые данные об использовании кетонов появились только в середине ХХ века [23]. Тем не менее, использование этой методики позволило получить довольно широкий круг соединений [16, 24—27].
Последующие исследования показали, что в ряде случаев замена конденсирующих агентов позволяет существенно увеличить выход реакции и минимизировать побочные процессы. Это позволило использовать в роли карбонильного агента как менее стабильные, так и менее реакционноспособ-ные соединения. Были применены такие конденсирующие агенты, как ЭСС (с микроволновым содействием) [28], ацетат свинца или цинка [29], хлорид цинка [30], триалкилхлорсиланы [31], ди-этилпирокарбонат [32], фторид калия на оксиде алюминия [34], ионообменные смолы и цеолиты [35, 36], комплекс серного ангидрида с диметил-ацетамидом [37], полифосфорная кислота [38] и т.п. (табл. 1).
Также и карбонильные компоненты могут быть заменены на различные аналоги, например,
на имины [39] или аддукты альдегидов с сульфитом натрия [40].
Как уже было сказано, одним из побочных процессов реакции Эрленмейера является переацили-рование ^-ацилглицинов. Данный процесс практически не наблюдается в мягких условиях, однако для малореакционноспособных субстратов он начинает играть существенную роль. Избежать подобной реакции удавалось либо упомянутым выше отказом от использования ангидрида, либо, например, заменой ЛС2о на ангидрид, соотв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.