БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2008, том 34, № 5, с. 630-638
УДК 577.112.6.083.3:615.371
СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛИСАХАРИД-ПЕПТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ ДЛЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ МЕНИНГОКОККОВ СЕРОГРУПП А И В
© 2008 г. М. П. Филатова**, О. В. Котельникова*, О. В. Чибискова*, О. Е. Лахтина*,
В.А. Несмеянов*, А. П. Аллилуев**, Д. О. Короев*, М. А. Титова*, Т. Д. Волкова*, О. М. Вольпина*, В. Т. Иванов*
*Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; **НИИ общей и клинической патологии РУДН, Москва Поступила в редакцию 01.08.2007 г. Принята к печати 28.11.2007 г.
Предложен новый подход к разработке вакцины против менингококков серогрупп А и В, заключающийся в синтезе конъюгатов высокомолекулярного капсульного полисахарида менингококка серогруппы А (PsA) с полученными ранее протективными синтетическими фрагментами мембранных белков менингококков серогруппы В.
Для синтеза конъюгатов был выбран метод, заключающийся в генерировании альдегидных групп путем окисления свободных вицинальных гидроксильных групп PsA и последующем их взаимодействии с аминогруппами пептида. Реакция протекает с промежуточным образованием основания Шиффа, которое восстанавливают до устойчивого вторичного амина. На примере синтеза конъюгата PsA с модельным пептидом проведена оптимизация основных параметров реакции и отработаны методы их характериза-ции. Воспроизводимость и эффективность методики синтеза продемонстрированы на примере получения конъюгатов PsA с фрагментами белка PorA внешней мембраны менингококка серогруппы В. Для конъюгата PsA с протективным пептидом, представляющим собой экспонированный консервативный фрагмент 306-332 белка PorA, показано, что введенный без адъюванта он стимулирует образование антител против пептидной и полисахаридной части молекулы и, кроме того, способен снижать уровень бактериемии у животных, зараженных менингококками серогрупп А и В. Показана возможность применения предложенного подхода для разработки комплексной вакцины против менингококков се-рогрупп А и В.
Ключевые слова: Neisseria meningitidis; синтетические пептиды; конъюгаты; капсульный полисахарид; иммуногенностъ; протективность.
ВВЕДЕНИЕ
Наиболее частой причиной менингококкового менингита, который характеризуется высокой смертностью и серьезными осложнениями, являются бактерии Neisseria meningitidis (N. meningitidis) серогрупп А, В и С. В настоящее время разработаны вакцины против менингококка серогрупп А и С на основе соответствующих капсульных полисахаридов [1]. В то же время использование полисахарида менингококка серогруппы В для вакцинации осложнено из-за его низкой протективной активности, а также опасности возникновения аутоиммунных
Сокращения: КОЕ - колониеобразующие клетки; НАФ - неполный адъювант Фрейнда; ПАФ - полный адъювант Фрейнда; PBS - 0.01 М раствор NaH2PO4 (pH 7.4); ИФА - им-муноферментный анализ.
# Автор для связи (тел.: (495) 336-57-77; эл. почта: filatova07@mail.ru).
заболеваний [2, 3]. В связи с этим интенсивно разрабатываются альтернативные подходы к созданию вакцины против менингококка серогруппы В, в том числе везикулярные вакцины на основе рекомби-нантных белков наружной мембраны бактерии. Некоторые из везикулярных вакцин в настоящее время проходят различные стадии клинических испытаний [4-7]. В то же время высокоэффективной поливалентной вакцины, защищающей от широкого спектра штаммов менингококка серогруппы В, в практической медицине пока не существует. В связи с актуальностью проблемы чрезвычайный интерес вызывают разработки принципиально новых подходов к созданию поливалентных противоме-нингококковых вакцин.
Нами предложен ранее не описанный подход к разработке вакцины против менингококка серогруппы В с использованием синтетических конъ-
1. R=H, R1=Ac
2. R=Ac, R1=H
Рис. 1. Структура звеньев капсульного полисахарида менингококка серогруппы А.
югатов капсульного полисахарида менингококка серогруппы А (PsA) с протективными синтетическими фрагментами белков менингококка серогруппы В. Ранее нами были синтезированы и изучены иммуноактивные фрагменты белков внешней мембраны N. meningitidis серогруппы B - белков PorA, OpaB и NspA [8-10]. Эти фрагменты включали экспонированные участки белков и были способны стимулировать протективный иммунитет у экспериментальных животных против менингококков серогруппы В и, в ряде случаев, менингококков серогруппы А [11]. Существенное ограничение практического применения этих соединений связано с необходимостью использования при введении пептидов полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), запрещенного к применению на людях.
Известно, что PsA является биополимером, который стимулирует противоменингококковый иммунный ответ в отсутствие адъюванта и разрешен к применению в качестве вакцины против менингококка серогруппы А [12]. Мы предположили, что конъюгаты PsA с синтетическими пептидами будут обладать иммуногенной активностью как пептидной, так и полисахаридной компоненты без применения адъюванта и будут защищать экспериментальных животных при заражении их менингококком серогрупп А и В.
Целью настоящего исследования явилась разработка простого и эффективного метода конденсации PsA с различными синтетическими фрагментами белков внешней мембраны менингококка серогруппы В, отработка методов характеристики полученных конъюгатов и изучение их иммуногенной и протективной активности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
PsА представляет собой высокомолекулярный биополимер, который состоит из повторяющихся звеньев N-ацетилманнозамина, соединенных 1-6-фосфодиэфирными связями, двух типов (рис. 1). Звенья 1-го типа включают 3,4-диольную группи-
ровку. Содержание таких звеньев в молекуле PsА, по данным различных литературных источников, составляет от 5 до 30% [13, 14]. В звеньях 2-го типа одна либо две гидроксильные группировки ацетили-рованы.
Для синтеза конъюгатов был выбран метод, заключающийся в генерировании альдегидов путем окисления вицинальных гидроксильных групп в звеньях 1-го типа PsA с помощью NaJO4 (рис. 2). При этом теоретически полисахаридная цепь PsA не должна разрушаться, что позволяет рассчитывать на сохранение антигенной активности препарата. Полученные альдегиды взаимодействуют с аминогруппами пептида с возникновением промежуточного основания Шиффа, которое восстанавливается в процессе реакции при действии NaCNBH3 с образованием устойчивого вторичного амина [15] (рис. 2). Этот метод первоначально был предложен для синтеза производных низкомолекулярных сахаров [15]. Использование его для синтеза конъюгатов частично гидролизованного PsA (М 25 кДа) со столбнячным анатоксином было впервые предложено Джен-нингсом [16]. Авторами была отмечена очень низкая скорость окисления не только внутренних, но и концевого остатков N-ацетилманнозамина. В связи с этим отработка конкретных условий синтеза конъюгатов высокомолекулярного PsA с пептидами по аналогичной схеме представляла самостоятельную проблему.
В настоящем исследовании были получены конъюгаты PsA-I, PsA-II, PsA-III, PsA-IV и PsA-V с пятью пептидами (I)-(V), структуры которых приведены на рис. 2. Пептид (I), использованный для оптимизиции условий получения конъюгатов, представляет собой модельное соединение (фрагмент 215-224 приона крупного рогатого скота [17]). Пептиды (II)-(IV) являются соответственно фрагментами 306-332, 273-292 и 364-373 белка PorA внешней мембраны N. meningitidis серогруппы В [18]: их локализация в структуре белка изображена на рис. 3. Конъюгат PsA-V на основе дипептида GV (V) был синтезирован для использования в качестве от-
О-
ОН
-О NHA(
ОН
0
1
O-P-II
О
IO4
—О.
О
0
1
О-P-II
О
Н-пептид-ОЫ NaCNBH3 "
Где пептид: KMMERVVEQM (I), либо ISYAHGFDFIERGKKGENTSYDQIIAG (II), либо AQLDLSENGDKTKNSTTEIA (III), либо AASVGLRHKF (IV), либо GP (V).
Рис. 2. Схема присоединения пептидов к окисляемому звену PsA.
рицательного контроля при биологических исследованиях, поскольку этот конъюгат включает модифицированную полисахаридную часть и неактивную пептидную часть, доступную для проведения аминокислотного анализа.
В полученных конъюгатах присоединение пептидов к окисленному Р8А может проходить по а-аминогруппам ^-концевых аминокислот или по е-аминогруппам остатков лизина. При конъюгации вследствие пространственного экранирования пептид может реагировать только с одной из двух альдегидных групп окисленного звена первого типа. Таким образом, конъюгат может представлять собой смесь из двух структур, приведенных на рис. 2.
Оптимизация основных параметров реакций окисления и восстановительного аминирования проводилась на примере синтеза конъюгата РэА-1, включающего модельный 10-членный пептид (I). Была изучена зависимость выхода и состава конъ-
югата РэА-1 от времени окисления Р8А (табл. 1). Показано, что увеличение времени окисления с 2 (опыт № 1) до 20 ч (опыт № 2) почти в 2 раза увеличивает содержание пептидной компоненты в РэА-1.
С учетом полученных данных, окисление Р8А осуществляли по модифицированной нами методике [19]. Реакцию проводили в течение 20 ч с использованием 3-кратного мольного избытка КаГО4 при 20°С в темноте; непрореагировавший периодат натрия "нейтрализовали" этиленгликолем.
Восстановительное аминирование проводили в №-фосфатном буфере с 20-кратным избытком №СКВН3 в течение 5 сут. Необходимо отметить, что в литературе описаны условия проведения реакции восстановительного аминирования в широком диапазоне рН [20]; у нас наиболее удовлетворительные результаты были получены при рН 7.5-8.0.
Таблица 1. Зависимость выхода и состава конъюгата РэА-Т от условий проведения реакции
Номер опыта Время окисления,ч Метод диализа Выход PsA-I, %* Соотношение фосфор-пептид, моль/моль
1 2 Мембрана Microcon YM-50 14 80 : 1
2 20 то же 18 48 : 1
3 20 Диализная пленка Servapor 60 15 : 1
* В расчете на PsA.
A S
20
Q v к
V
т к
V 40
т к
А К S r I
r Т
К 50 I
D Т
К N G
Т 180 N I S
Y N L G 240
130 D V Y L F S
N А А Т L D
N S Р L Е Q
S Q Т V 190 F А
D L Y Р А К
W G А А N 230 G
G А
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.