РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 41-47
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
СИНТЕЗ И ПРОДУКЦИЯ RAGE МОНОЦИТАМИ ПРИ ЭНДОМЕТРИОЗЕ: СВЯЗЬ С СОСТОЯНИЕМ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ ПАЦИЕНТОК
© 2014 г. Ю.С. Анциферова*, Н.Ю. Сотникова*, З. Улкова-Галова**, А.И. Малышкина*, А.К. Красильникова*, С.В. Романова*
*Лаборатория клинической иммунологии ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения
Российской Федерации, Иваново, Россия;
**Департамент гинекологии и акушерства Карловского университета и лечебного факультета,
Пльзень, Чешская Республика
Поступила: 27.11.2013. Принята: 21.01.2014
Целью работы было установить особенности сывороточного содержания RAGE и синтеза его моноцитами при эндометриозе в зависимости от стадии распространенности заболевания и состояния репродуктивной функции пациенток для уточнения иммунных механизмов развития эндометриоза и связанного с ним бесплодия. Было проведено обследование 80 женщин с наружным генитальным эндометриозом и 16 здоровых фертильных женщин (контрольная группа). Сывороточное содержание RAGE определялось методом ИФА, уровень экспрессии мРНК RAGE в популяции CD14+ моноцитов оценивали методом ПЦР в режиме реального времени. Было выявлено повышение сывороточного содержания RAGE в общей группе женщин с эндометриозом, которое коррелировало со стадией эндометриоза и с наличием у пациенток бесплодия. Экспрессия мРНК RAGE моноцитами также была повышена в общей группе женщин с эндометриозом и у пациенток с эндометриозом и бесплодием. Успех хирургического лечения бесплодия и ЭКО у пациенток с эндометриозом был ассоциирован с изначально низким сывороточным содержанием RAGE.
Ключевые слова: RAGE, моноциты, эндометриоз, бесплодие
ВВЕДЕНИЕ
Достаточно давно была установлена важная роль сигнальных рецепторов фагоцитов класса PRR (pathogen recognition receptors) в регуляции реакций врожденного иммунитета [1]. В настоящее время представления о функционировании PRR существенно расширились. Ранее к PRR относили сигнальные рецепторы фагоцитов, такие как TLRs и NLRs, активация которых проходит при их взаимодействии со специфическими лигандами из класса PAMP (pathogen associated molecular patterns), имеющими преимущественно экзогенное инфекционное происхождение [1]. В последние годы к PRR стали относить
рецепторы, участвующие в проведении сигнала под действием лигандов неифекционной природы, имеющих эндогенное происхождение, которые получили название аларми-ны, или DAMP молекулы (damage associated molecular patterns) [2]. Одним из таких рецепторов является RAGE (receptor for advanced glycation end products). Изначально RAGE был описан как рецептор, распознающий конечные продукты гликозилирования протеинов — AGE, которые образуются в результате неэнзиматической реакции альдегидного мотива глюкозы с амино-группами протеинов и после реаранжировки остаются необратимо связанными с протеинами [3]. Затем было установлено, что RAGE также вовлекается в распознавание эндогенных молекул, высвобождающихся при стрессе или хроническом воспалении [4]. К специфическим лигандам RAGE относятся члены семейства SlOO/каль-
Адрес: 153009, Иваново, ул. Мякишева, д. 5., кв. 24, Анциферовой Ю.С. E-mail: niimid.immune@mail.ru
гранулинов, HMGB (highmobility group box)-1 молекулы, а также амилоидный ß-пептид и амилоид А [3, 5]. Ингейджмент RAGE приводит к запуску внутриклеточного сигнального каскада, активирующего транскрипционные факторы NF-kB и Egr-1, что в конечном итоге индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов [5]. Кроме того, RAGE действует как эндотелиальный адгезионный рецептор для лейкоцитарных интегринов и усиливает миграцию лейкоцитов [6]. Эти свойства RAGE определяют его важную роль в развитии воспалительных реакций, опосредованных фагоцитарными клетками.
Воспаление лежит в основе патогенеза большого количества заболеваний, в число которых входит и эндометриоз [7]. Эндомет-риоз в настоящее время считается одной из наиболее распространенных гинекологических патологий, которая встречается у 5—10% всех женщин репродуктивного возраста [8]. Наиболее яркими клиническими симптомами эндометриоза, существенно снижающими качество жизни пациенток, являются болевой синдром и бесплодие. По данным литературы, у 40 — 60% женщин с бесплодием диагностируется эндометриоз [8]. До настоящего времени нет четкого представления о связи между эндометриозом и бесплодием. Многие исследователи считают, что в основе механизмов развития как эндометриоза, так и связанного с ним бесплодия лежат иммунные нарушения, обусловленные прежде всего реакциями врожденного иммунитета [9, 10]. Установлено, что при эндометриозе в перитонеальной полости, где наиболее часто локализуются эндометриоидные очаги, резко повышается содержание макрофагов, усиливается продукция ими провоспалительных цитокинов и факторов роста [10, 11]. Считается, что эти изменения приводят к развитию локального перитонеального воспаления и создают условия, благоприятные для роста и развития эктопического эндометрия [9]. Кроме того, по мнению многих авторов, перито-неальное микроокружение играет важную роль и в нарушениях репродуктивных процессов при эндометриозе [10]. Менее ясна роль системного воспаления в развитии эндо-метриоза. Несмотря на то, что у пациенток с эндометриозом, по данным литературы, есть признаки субклинического воспаления [12], механизмы, участвующие в реализации воспалительного процесса на системном уровне при эндометриозе, до конца не установлены.
Нет данных о возможном участии RAGE в регуляции системного воспаления при эндометриозе и связанном с ним бесплодии.
В связи с этим целью настоящей работы было установить особенности сывороточного содержания RAGE и синтеза его моноцитами при эндометриозе в зависимости от стадии распространенности заболевания и состояния репродуктивной функции пациенток для уточнения иммунных механизмов развития эндометриоза и связанного с ним бесплодия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты
Основную группу составили 60 женщин с наружным генитальным эндометриозом, поступивших в гинекологическую клинику ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России (г. Иваново, Россия), и 20 женщин, находившихся на лечении в гинекологической клинике лечебного факультета Карловского университета (г. Пльзень, Чешская Республика) по поводу болевого синдрома или бесплодия. 16 здоровых фертильных женщин, обратившихся на прием к гинекологу по поводу планирования беременности, составили контрольную группу. Обследованные женщины находились в возрастных пределах 22 — 35 лет.
Всем пациенткам основной группы проводилась лечебно-диагностическая лапароскопия, в ходе которой был подтвержден диагноз эндометриоза. У 63 женщин был диагностирован эндометриоз 1 — 2 стадии по классификации Американского Общества Фертильности (ASF), у 17 женщин — эндометриоз 3 — 4 стадии. Бесплодие было выявлено у 67 обследованных пациенток, у 13 женщин не отмечали нарушений фертильности. Нами был прослежен отдаленный эффект лапароскопии на восстановление фертильности у 26 женщин основной группы. Было установлено, что в течение первого года после операции у 5 из 26 женщин впоследствии наступила беременность, закончившаяся своевременными родами, а у остальных женщин этой подгруппы восстановления фертильности не произошло. 12 пациенток основной группы после лапароскопии участвовали в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), и наступление беременности после ЭКО было отмечено только у 6 из них.
Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь. Исследования были одобрены локальным этическим комитетом ФГБУ «Ив НИИ МиД им.В.Н.Городкова» Минздрава России и проводились с информированного согласия пациенток.
Проведение иммуноферментных исследований
Содержание RAGE в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Finland) с использованием коммерческой тест-системы (R&D, USA). Анализ проводился в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Предел чувствительности тест-системы составлял 1,23 пг/мл.
Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови
Выделение обогащенной популяций мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078).
Проведение количественной полимеразной
цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени
Экспрессию мРНК RAGE моноцитами периферической крови оценивали методом полимеразной цепной реакции (PCR) в масштабе реального времени. Предварительно проводили выделение чистой популяции CD14+ моноцитов из фракции МНК периферической крови методом магнитной сепарациии с использованием магнитных частиц, коньюгированных с анти-CDM антителами (Dynabeads® CD14, Invitrogen by Life Technologies AS, Oslo, Norway) в соответствии с инструкцией фирмы-разработчика. Образцы моноцитов лизировали в растворе, содержащем гуанидинтиоцианат, цитрат натрия, саркозил и 2-меркаптоэтанол. Выделение тотальной РНК из обогащенной фракции CD14+ клеток проводили стандартным гуанидин-ти-оцианат-фенол-хлороформ методом. Полученную РНК переводили в комплементарную кДНК, используя рендом-гексамеры и обратную транскриптазу (Promega, USA). Реакцию
обратной транскрипции проводили при 70° C в течение 3 мин и при 37 °C в течение 90 мин.
В работе проводили определение экспрессии мРНК RAGE и р2-микроглобулина, который использовали в качестве гена домашнего хозяйства. Для проведения количественной ПЦР в реальном времени использовались коммерческие наборы из ферментов, прай-меров и зондов производства ООО «Синтол» (Москва, Россия). Реакцию амплификации проводили в соответствии с предложенными протоколами ООО «Синтол» на амплификато-ре с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD Laboratories, California, USA). В каждом образце определяли количество копий нуклеотидов Р2-микроглобулина и RAGE с использованием серии десятикратных разведений образцов контрольной кДНК. Количество копий пар нуклеотидов ге
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.