научная статья по теме СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ХРОМОФОРОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ Химия

Текст научной статьи на тему «СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ХРОМОФОРОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2009, том 35, № 6, с. 726-743

= ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

УДК 577.112.854 : 577.344 : 547.782538.14.057

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ХРОМОФОРОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ

© 2009 г. П. Е. Ивашкин, И. В. Ямпольский, К. А. Лукьянов*

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 07.05.2009 г. Принята к печати 24.06.2009 г.

Рассмотрены существующие подходы к химическому синтезу 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов - модельных хромофоров флуоресцентных белков и их неприродных аналогов. Подробно обсуждаются химические свойства (кислотно-основные и окислительно-восстановительные, цис-транс-изоме-рия и др.) и спектральные особенности хромофоров, а также влияние заместителей и окружения. Изучение синтетических хромофоров позволяет моделировать фотофизические характеристики флуоресцентных белков.

Ключевые слова: флуоресцентный белок; хромобелок; хромофор; имидазолон; ОГР.

введение

Белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP широко известны благодаря возможности их использования в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток для визуализации процессов жизнедеятельности отдельных клеток и целых организмов [1, 2]. Отличительной особенностью белков этого семейства является уникальный автокаталитический механизм формирования хромофора внутри молекулы белка за счет модификаций собственных аминокислотных остатков.

Первый зеленый флуоресцентный белок был найден в гидроидной медузе Aequorea victoria [3, 4]. Позже в коралловых полипах были открыты желтые, оранжевые и красные флуоресцентные белки, а также нефлуоресцентные хромобелки [2, 5]. Исследования последних лет показали, что спектральное разнообразие белков семейства GFP обеспечивается разнообразием химических структур их хромофоров [6, 7].

В настоящее время известно несколько структурных типов хромофоров белков семейства GFP (схема 1), среди которых хромофор зеленого типа (G) обладает простейшим строением. В соответствии с существующими гипотезами, хромофор зеленого типа является непосредственным предшественником прочих структур [7, 8]. Так, хромофор Kaede-типа (K) образуется в результате фотохимического элиминирования ациламиногруппы [9], в то время как созревание прочих хромофоров (D, A, Z, O) проходит через дополнительную стадию окисления.

Сокращения: GFP - зеленый флуоресцентный белок; Tf -трифторметансульфонил. # Автор для связи (тел.: (495) 429-80-20; эл. почта: kluk@ibch.ru).

Помимо небольшого числа белковых хромофоров было синтезировано несколько десятков 5-ари-лиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, не имеющих природных аналогов (см. таблицу и ссылки в ней). Основную их часть составляют соединения (I) с ароматическими заместителями R1 и R3 (рисунок).

Синтез модельных соединений позволил установить строение хромофоров в белках, изучить спектральные характеристики природных и неприродных 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, изучить влияние белкового окружения [10]. В перспективе такие соединения могут быть использованы при изучении механизмов созревания и функционирования хромофоров, а также с целью создания новых флуоресцентных красителей с уникальными свойствами.

Синтез модельных хромофоров флуоресцентных белков тесно связан с проблемой определения химического строения нативных хромофоров. Доказательство строения вРР-хромофора проходило в несколько этапов. Вначале первооткрыватель вРР О. Шимомура установил аминокислотную последовательность пептида, полученного при гидрировании окрашенной фракции лизата вРР, и выделил 4-гидроксибензальдегид в качестве продукта гидролиза хромофора, показал спектральное сходство синтезированного 5 -арилиден-3,5 -дигидро-4Я-имидазол-4-она 01 (Д1 = ОД; R2 = СН2С02Н; R3 = 4-^0^ рисунок) и окрашенного продукта протеолиза вРР [10]. Значительно позднее, после успешного клонирования гена вРР [3], было проведено сравнение структур белкового и синтетического хромофоров методом масс-спектрометрии [11], а также непосредственное определение структуры нативного белка с помощью РСА [12, 13]. В настоящее время РСА стал основным методом исследования структуры хромофоров в различных флуоресцентных

синтез и свойства хромофоров флуоресцентных белков

727

он

л

о- -V

О (ОРР)

я

о-

К (Kaede)

он

он

о

н2о

о

Б (DsRed)

я

о-

Z (zFP538)

о

о

n

А (AsFP595)

)3^И2 он Р =

ф ОН

НО

О (КшаЫга Огап§е)

Схема 1. Структурные типы хромофоров GFP-пoдoбныx белков и пути их образования из хромофора зеленого типа.

белках [6]. В то же время кристаллографическое определение структуры не всегда допускает однозначную интерпретацию и малоинформативно при изучении химии и фотохимии хромофоров. Именно поэтому синтез и изучение низкомолекулярных модельных соединений остаются важными задачами, особенно ввиду возрастающего разнообразия известных структур хромофоров.

Несмотря на то что химическая структура большинства известных белковых хромофоров считается надежно установленной, детали стереохимии, кислотно-основных взаимодействий, а также химия возбужденного состояния остаются недостаточно изученными. В то же время перечисленные особенности хромофоров важны для понимания таких

процессов, происходящих в нативных белках, как фотоактивация [14], фотопереключение [15], фотообесцвечивание [16], фототоксичность [17], созревание сложных хромофоров и др.

В данном обзоре мы рассмотрим методы синтеза соединений, моделирующих хромофоры вРР-по-добных белков, и обобщим результаты, полученные при изучении этих соединений, а также опишем их использование для объяснения спектральных и биохимических свойств флуоресцентных белков.

методы синтеза хромофоров

Впервые синтез модельного хромофора зеленого флуоресцентного белка был описан первоот-

я3

о

N5

-И2

R1, R3 = А1к, Аг R2 = Н, А1к, Аг

И1

(I)

Общая схема строения 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов.

Спектральные характеристики ОБР-подобных хромофоров

Я3 (рисунок) Я1 (рисунок) Среда ^тпах поглощ., нм е х 103 л/(моль ■ см) ^шах эмиссии, нм Ф Лиг-ра

СНз I 435 55 490а <0.0001 [11]

\ г

СНз II 430 нет данных нет данных нет данных [60]

н

/=\ Р

Л СНз I 542 72 603е 0.0021е [27]

нет данных нет

III 470 538 данных [32]

/--МН I 502 79 582е 0.005е [30]

I 522 61 625 0.016 [30]

Н I 509 24 615 0.017 [30]

I 513 45 635 0.009 [30]

о I 531 36 642е 0.005е [30]

III 460 нет данных 530 0.0006 [31]

Таблица. Продолжение

Я3 (рисунок) Я1 (рисунок) Среда ^шах поглощ., нм е х 10з л/(моль -см) ^шах эмиссии, нм Ф Лит-ра

I 509 з4 610 0.017 [з0]

Н

I 508 2з 625 0.016 [з0]

\|_У

Н

СНз ряд раств. ~з70 нет данных ~450 нет данных [61]

Я = СНз, СбН1з, С12Н25

-о СНз IV з72 25 420а нет данных [20]

СНз IV з72 25 467а нет данных [20]

Н

-О" СНз IV 287 19 402а нет данных [20]

-р СНз I 445 нет данных 580 0.001 [62]

но7

СН3 V ~з50 нет данных 440ь 0.02зь [бз]

ю -О VI з84 1з 444 0.0012 [64]

-о -О""0™5 VI з87 26 452 0.0з2 [64]

-О"001' -О VI з98 15 464 0.0002 [64]

Таблица. Окончание

R3 (рисунок) R1 (рисунок) Среда ^max поглощ., нм e x 103 л/(моль -см) ^max эмиссии, нм Ф Лит-ра

VI 383 22 451 0.135 [64]

^—V OCH3 VI 405 23 510 0.258 [64]

/=\ ,CH3 VI 454 39 520 0.0020 [64]

H3C N CH3 / F2B CH3 VII 492 57 532 0.86 [65]

I) EtOH/OH-; II) H2O; III) H2O/OH-; IV) EtOH; V)MeOH/H2O/OH-; VI) диоксан; VII) MeOH. a) EtOH/OH-, 77 K; b) MeOH/H2O 1 : 1; c) DMF/OH-.

крывателем GFP O. Шимомурой в 1979 г. [10]. Вы- тическим альдегидом (схема 2). Данная реакция от-

бранный им метод основан на реакции глицилгли- личается очень низким выходом и не позволяет син-

цина (II) с масляным ангидридом и последующей тезировать более сложные хромофоры. конденсации полученного соединения (III) с арома-

H

O O

H2N

N^ XO2H _O_PL

O

N

(II)

O

N

Pr (III)

CO2H

HO,

O

HO

CO2H

Pr

Gl

Схема 2. Синтез первого модельного соединения Gl.

O

В настоящее время можно выделить два общих подхода к синтезу 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов. Первый из них, как и метод [10] Шимомуры, заключается в предварительной сборке 3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онового ядра и последующей конденсации с замещенными ароматическими альдегидами (схема 3). Примером может служить реакция амидинов (IV) с

эфирами хлор- и бромуксусной кислот (V) (путь а) [ 18-21], либо глиоксалем (VI) (путь Ь) [22]. К настоящему времени данным методом были получены лишь простейшие 2-замещенные хромофоры. В случае алкиламидинов выходы чрезвычайно низки [20]. Кроме того, жесткие условия синтеза алкиламидинов не позволяют получать соединения с функционализированным алифатиче-

ским остатком во втором положении цикла. К ствие иминоэфиров (VII) с эфиром глицина (VIII) аналогичному результату приводит взаимодей- (путь с) [2з, 24].

O

NH R^ +

nh2 R'o (IV) 2 (V)

NH

На1

R С

(IV)

NH2

NH

+ O^-^ (VI)

O

O

bEt 2

(VII) (VIII)

N

O H0

NH

R

HO

O

NH

R

(I)

R = Ar, Me R' = Me, Et

Схема 3. Синтез хромофоров на основе 2-арил-з,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов.

a

O

b

Альтернативный подход к синтезу 5-арилиден-з,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов основан на реакции циклизации амидов Л-ацилдегидроаминокислот (IX) при нагревании либо под действием оснований (етема 4, внизу). Амиды Л-ацилдегидроаминокис-лот реагируют намного быстрее и с более высокими выходами, чем их насыщенные аналоги (метод [10]), поскольку продуктом циклизации является ароматический гетероцикл.

Амиды Л-ацилдегидроаминокислот (IX) могут быть получены рядом способов, наиболее универсальным из которых является конденсация карбонильных соединений с производными глицина с повышенной СН-кислотностью. К настоящему времени в качестве таких производных применялись только насыщенные азлактоны (X) [25-27], что обусловлено простотой их получения и достаточно высокой реакционной способностью (схема 4).

H

Y

O

N

O HO

O

AcONa

AcO

R1

(X)

R1 = Alk, Ar R2 = H, Alk

O O R1

O

r2nh2

HO

NHR2

A/Base

H^ R1

T

O

(IX)

HO

O

N

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»