БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2009, том 35, № 6, с. 726-743
= ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.112.854 : 577.344 : 547.782538.14.057
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ХРОМОФОРОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ
© 2009 г. П. Е. Ивашкин, И. В. Ямпольский, К. А. Лукьянов*
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 07.05.2009 г. Принята к печати 24.06.2009 г.
Рассмотрены существующие подходы к химическому синтезу 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов - модельных хромофоров флуоресцентных белков и их неприродных аналогов. Подробно обсуждаются химические свойства (кислотно-основные и окислительно-восстановительные, цис-транс-изоме-рия и др.) и спектральные особенности хромофоров, а также влияние заместителей и окружения. Изучение синтетических хромофоров позволяет моделировать фотофизические характеристики флуоресцентных белков.
Ключевые слова: флуоресцентный белок; хромобелок; хромофор; имидазолон; ОГР.
введение
Белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP широко известны благодаря возможности их использования в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток для визуализации процессов жизнедеятельности отдельных клеток и целых организмов [1, 2]. Отличительной особенностью белков этого семейства является уникальный автокаталитический механизм формирования хромофора внутри молекулы белка за счет модификаций собственных аминокислотных остатков.
Первый зеленый флуоресцентный белок был найден в гидроидной медузе Aequorea victoria [3, 4]. Позже в коралловых полипах были открыты желтые, оранжевые и красные флуоресцентные белки, а также нефлуоресцентные хромобелки [2, 5]. Исследования последних лет показали, что спектральное разнообразие белков семейства GFP обеспечивается разнообразием химических структур их хромофоров [6, 7].
В настоящее время известно несколько структурных типов хромофоров белков семейства GFP (схема 1), среди которых хромофор зеленого типа (G) обладает простейшим строением. В соответствии с существующими гипотезами, хромофор зеленого типа является непосредственным предшественником прочих структур [7, 8]. Так, хромофор Kaede-типа (K) образуется в результате фотохимического элиминирования ациламиногруппы [9], в то время как созревание прочих хромофоров (D, A, Z, O) проходит через дополнительную стадию окисления.
Сокращения: GFP - зеленый флуоресцентный белок; Tf -трифторметансульфонил. # Автор для связи (тел.: (495) 429-80-20; эл. почта: kluk@ibch.ru).
Помимо небольшого числа белковых хромофоров было синтезировано несколько десятков 5-ари-лиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, не имеющих природных аналогов (см. таблицу и ссылки в ней). Основную их часть составляют соединения (I) с ароматическими заместителями R1 и R3 (рисунок).
Синтез модельных соединений позволил установить строение хромофоров в белках, изучить спектральные характеристики природных и неприродных 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, изучить влияние белкового окружения [10]. В перспективе такие соединения могут быть использованы при изучении механизмов созревания и функционирования хромофоров, а также с целью создания новых флуоресцентных красителей с уникальными свойствами.
Синтез модельных хромофоров флуоресцентных белков тесно связан с проблемой определения химического строения нативных хромофоров. Доказательство строения вРР-хромофора проходило в несколько этапов. Вначале первооткрыватель вРР О. Шимомура установил аминокислотную последовательность пептида, полученного при гидрировании окрашенной фракции лизата вРР, и выделил 4-гидроксибензальдегид в качестве продукта гидролиза хромофора, показал спектральное сходство синтезированного 5 -арилиден-3,5 -дигидро-4Я-имидазол-4-она 01 (Д1 = ОД; R2 = СН2С02Н; R3 = 4-^0^ рисунок) и окрашенного продукта протеолиза вРР [10]. Значительно позднее, после успешного клонирования гена вРР [3], было проведено сравнение структур белкового и синтетического хромофоров методом масс-спектрометрии [11], а также непосредственное определение структуры нативного белка с помощью РСА [12, 13]. В настоящее время РСА стал основным методом исследования структуры хромофоров в различных флуоресцентных
синтез и свойства хромофоров флуоресцентных белков
727
он
л
о- -V
О (ОРР)
я
о-
К (Kaede)
он
он
о
н2о
о
Б (DsRed)
я
о-
Z (zFP538)
о
о
n
А (AsFP595)
)3^И2 он Р =
ф ОН
НО
О (КшаЫга Огап§е)
Схема 1. Структурные типы хромофоров GFP-пoдoбныx белков и пути их образования из хромофора зеленого типа.
белках [6]. В то же время кристаллографическое определение структуры не всегда допускает однозначную интерпретацию и малоинформативно при изучении химии и фотохимии хромофоров. Именно поэтому синтез и изучение низкомолекулярных модельных соединений остаются важными задачами, особенно ввиду возрастающего разнообразия известных структур хромофоров.
Несмотря на то что химическая структура большинства известных белковых хромофоров считается надежно установленной, детали стереохимии, кислотно-основных взаимодействий, а также химия возбужденного состояния остаются недостаточно изученными. В то же время перечисленные особенности хромофоров важны для понимания таких
процессов, происходящих в нативных белках, как фотоактивация [14], фотопереключение [15], фотообесцвечивание [16], фототоксичность [17], созревание сложных хромофоров и др.
В данном обзоре мы рассмотрим методы синтеза соединений, моделирующих хромофоры вРР-по-добных белков, и обобщим результаты, полученные при изучении этих соединений, а также опишем их использование для объяснения спектральных и биохимических свойств флуоресцентных белков.
методы синтеза хромофоров
Впервые синтез модельного хромофора зеленого флуоресцентного белка был описан первоот-
я3
о
N5
№
-И2
R1, R3 = А1к, Аг R2 = Н, А1к, Аг
И1
(I)
Общая схема строения 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов.
Спектральные характеристики ОБР-подобных хромофоров
Я3 (рисунок) Я1 (рисунок) Среда ^тпах поглощ., нм е х 103 л/(моль ■ см) ^шах эмиссии, нм Ф Лиг-ра
СНз I 435 55 490а <0.0001 [11]
\ г
СНз II 430 нет данных нет данных нет данных [60]
н
/=\ Р
Л СНз I 542 72 603е 0.0021е [27]
нет данных нет
III 470 538 данных [32]
/--МН I 502 79 582е 0.005е [30]
I 522 61 625 0.016 [30]
Н I 509 24 615 0.017 [30]
I 513 45 635 0.009 [30]
о I 531 36 642е 0.005е [30]
III 460 нет данных 530 0.0006 [31]
Таблица. Продолжение
Я3 (рисунок) Я1 (рисунок) Среда ^шах поглощ., нм е х 10з л/(моль -см) ^шах эмиссии, нм Ф Лит-ра
I 509 з4 610 0.017 [з0]
Н
I 508 2з 625 0.016 [з0]
\|_У
Н
СНз ряд раств. ~з70 нет данных ~450 нет данных [61]
Я = СНз, СбН1з, С12Н25
-о СНз IV з72 25 420а нет данных [20]
СНз IV з72 25 467а нет данных [20]
Н
-О" СНз IV 287 19 402а нет данных [20]
-р СНз I 445 нет данных 580 0.001 [62]
но7
СН3 V ~з50 нет данных 440ь 0.02зь [бз]
0Н
ю -О VI з84 1з 444 0.0012 [64]
-о -О""0™5 VI з87 26 452 0.0з2 [64]
-О"001' -О VI з98 15 464 0.0002 [64]
Таблица. Окончание
R3 (рисунок) R1 (рисунок) Среда ^max поглощ., нм e x 103 л/(моль -см) ^max эмиссии, нм Ф Лит-ра
VI 383 22 451 0.135 [64]
^—V OCH3 VI 405 23 510 0.258 [64]
/=\ ,CH3 VI 454 39 520 0.0020 [64]
H3C N CH3 / F2B CH3 VII 492 57 532 0.86 [65]
I) EtOH/OH-; II) H2O; III) H2O/OH-; IV) EtOH; V)MeOH/H2O/OH-; VI) диоксан; VII) MeOH. a) EtOH/OH-, 77 K; b) MeOH/H2O 1 : 1; c) DMF/OH-.
крывателем GFP O. Шимомурой в 1979 г. [10]. Вы- тическим альдегидом (схема 2). Данная реакция от-
бранный им метод основан на реакции глицилгли- личается очень низким выходом и не позволяет син-
цина (II) с масляным ангидридом и последующей тезировать более сложные хромофоры. конденсации полученного соединения (III) с арома-
H
O O
H2N
N^ XO2H _O_PL
O
N
(II)
O
N
Pr (III)
CO2H
HO,
O
HO
CO2H
Pr
Gl
Схема 2. Синтез первого модельного соединения Gl.
O
В настоящее время можно выделить два общих подхода к синтезу 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов. Первый из них, как и метод [10] Шимомуры, заключается в предварительной сборке 3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онового ядра и последующей конденсации с замещенными ароматическими альдегидами (схема 3). Примером может служить реакция амидинов (IV) с
эфирами хлор- и бромуксусной кислот (V) (путь а) [ 18-21], либо глиоксалем (VI) (путь Ь) [22]. К настоящему времени данным методом были получены лишь простейшие 2-замещенные хромофоры. В случае алкиламидинов выходы чрезвычайно низки [20]. Кроме того, жесткие условия синтеза алкиламидинов не позволяют получать соединения с функционализированным алифатиче-
ским остатком во втором положении цикла. К ствие иминоэфиров (VII) с эфиром глицина (VIII) аналогичному результату приводит взаимодей- (путь с) [2з, 24].
O
NH R^ +
nh2 R'o (IV) 2 (V)
NH
На1
R С
(IV)
NH2
NH
+ O^-^ (VI)
O
O
bEt 2
(VII) (VIII)
N
O H0
NH
R
HO
O
NH
R
(I)
R = Ar, Me R' = Me, Et
Схема 3. Синтез хромофоров на основе 2-арил-з,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов.
a
O
b
Альтернативный подход к синтезу 5-арилиден-з,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов основан на реакции циклизации амидов Л-ацилдегидроаминокислот (IX) при нагревании либо под действием оснований (етема 4, внизу). Амиды Л-ацилдегидроаминокис-лот реагируют намного быстрее и с более высокими выходами, чем их насыщенные аналоги (метод [10]), поскольку продуктом циклизации является ароматический гетероцикл.
Амиды Л-ацилдегидроаминокислот (IX) могут быть получены рядом способов, наиболее универсальным из которых является конденсация карбонильных соединений с производными глицина с повышенной СН-кислотностью. К настоящему времени в качестве таких производных применялись только насыщенные азлактоны (X) [25-27], что обусловлено простотой их получения и достаточно высокой реакционной способностью (схема 4).
H
Y
O
N
O HO
O
AcONa
AcO
R1
(X)
R1 = Alk, Ar R2 = H, Alk
O O R1
O
r2nh2
HO
NHR2
A/Base
H^ R1
T
O
(IX)
HO
O
N
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.