БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2001, том 27, № 3, с. 163-173
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.152.344
Посвящена памяти В.М. Степанова, руководившего работами по ферментативному синтезу пептидил-а-аминоальдегидов
СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ НА С-КОНЦЕ а-АМИНОАЛЬДЕГИДЫ © 2001 г. Ж. В. Потетинова*, Е. И. Мильготина, В. А. Макаров4*, Т. Л. Воюшина
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, лаборатория химии белка им. В.М. Степанова,
113545, Москва, 1-й Дорожный пр., 1; * Гематологический научный центр РАМН, лаборатория патологии и фармакологии гемостаза, Москва Поступила в редакцию 24.11.2000 г. Принята к печати 15.01.2001 г.
Рассмотрены различные методы получения модифицированных пептидов - пептидил-а-аминоаль-дегидов, обладающих способностью ингибировать целый ряд протеолитических ферментов, относящихся к классу тиоловых, сериновых и аспартильных протеиназ. Подробно обсуждаются химические пути синтеза пептидил-а-аминоальдегидов, в том числе и широко использующиеся в настоящее время твердофазные методы синтеза, а также биокаталитические способы получения данного класса соединений.
Ключевые слова: пептидил-а-аминоальдегиды; химический синтез; ферментативный синтез; ингибиторы протеиназ.
&
Введение.
1. Оптическая стабильность пептидил-а-аминоальдегидов.
2. Химические методы синтеза пептидил-а-аминоальдегидов.
2.1. Конденсация производных а-аминоальде-гидов с эфирами /У-защищенных аминокислот и пептидов.
2.2. Получение через лактам аргинина.
2.3. Твердофазный синтез.
2.4. Получение через модифицированные пептиды или производные пептидов.
3. Ферментативные пути синтеза пептидил-а-аминоальдегидов.
Заключение.
Сокращения: Pheol - фенилаланинол ((З-аминоспирт); Pheal - фениладаниналь (а-аминоальдегид); Pheal=Sem -семикарбазон фенилаланиналя; МВНА - и-метилбензгид-риламин; Aloe - аллилоксикарбонил; ВОР - гексафторфо-сфат (бензотриазол-1 -илокси)трис(диметиламино)фосфо-ния; DIPEA - /УД-диизопропилэтиламин; Рр - пропионил; Tig - 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-ил-карбонил.
#Автор для переписки (e-mail: potetinov@hotmail.com; тел.: (095) 315-37-38; факс: (095) 315-05-01).
ВВЕДЕНИЕ
Пептидил-а-аминоальдегиды (пептидальдеги-ды) - модифицированные пептиды, имеющие на С-конце аналог а-аминокислоты - а-аминоаль-дегид.
nh2-ch-r
i
сн,
И = СООН Фенилаланин (РЬе) К = СН2ОН Фенилаланинол (РЬео1) К = С(0)Н Фенилаланиналь (РЬеа1) Я = СНШНСОШ2 Семикарбазон фенилаланиналя (РЬеа1=5ет)
Пептидальдегиды представляют собой ингибиторы тиоловых и сериновых протеиназ [1-3]. При взаимодействии с сериновой протеиназой пептидная часть подобной молекулы контактирует с субстратсвязывающим участком фермента, а альдегидная группа образует тетраэдрический полуацеталь с гидроксилом серина активного центра - непродуктивный аналог переходного состояния [4]. В последнее время появились данные
CH2R' CH2R' CH2R'
I „Н JHT. I ^H -H+, I /ОН
RNH-CH-C^. RNH-CH-C^ RNH~C=C^
(I) (И) (III)
Схема 1. Механизм рацемизации защищенных а-аминоальдегидов [20].
о том, что пептидил-а-аминоальдегиды ингиби-руют также и аспартильные протеиназы (HIV-протеиназы [5], ренин [6] и конвертазы [7]). Механизм этого процесса изучен пока недостаточно, высказано лишь предположение, что они образуют, подобно сериновым и тиоловым протеиназам, тетраэдрическую гидратированную форму - аналог переходного состояния [8]. Константы ингиби-рования пептидальдегидами различных классов протеиназ колеблются в пределах lCH-lO'9 М.
Пептидальдегиды - обратимые ингибиторы, тем не менее они могут оказаться весьма эффективными лекарственными препаратами. Так, например, пептидальдегиды, содержащие остатки Nvaal и Nleal, являются ингибиторами протеасо-мы - ключевого мультиферментного комплекса многих катаболических каскадов [9]. В ряде работ, опубликованных в последнее время, показано, что соединения Z-Leu-Leual и Z-Leu-Leu-Nvaal могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера [10]. Особый интерес представляют производные пептидов, имеющие на С-конце ар-гининаль или лизиналь [11, 12], ингибирующие сериновые протеиназы, входящие в состав системы гемостаза. Пептидальдегиды, содержащие на С-конце модифицированные остатки Glu и/или Asp, способны ингибировать глутамил- и/или аспа-рагилспецифичные эндопептидазы, многие из которых имеют важное биологическое значение (ин-терлейкин-^-превращающий фермент [13], гран-зим В [14]). В вирусе гепатита А, полио- и риновирусах человека был обнаружен ряд вирусных сериновых протеиназ, гидролизующих пептидные связи типа Glu-Xaa и Gln-Xaa и играющих ключевую роль в процессинге вирусных полипептидов в функциональные продукты [15]. Ингибиторами подобных ферментов могут служить производные пептидов, имеющие на С-конце альдегиды глутаминовой кислоты или глутамина. Пептидальдегиды, содержащие на С-конце остатки гидрофобных аминокислот, являются ингибиторами целого ряда тиоловых протеиназ (принадлежащих семейству папаина), необходимых для внутриклеточной репликации и дифференциации многим патогенным микроорганизмам (Trypanosoma cruzi, Leishmania major, Plasmodium falciparum) [16].
Кристаллизация ферментов в комплексе с пептидальдегидами в значительной степени облегчает определение структуры этих ферментов методом
рентгеноструктурного анализа [17]. При иммобилизации пептидальдегидов на носителе получают специфичные аффинные сорбенты [18, 19], применение которых открывает новые перспективы для выделения и исследования протеолитических ферментов.
1. ОПТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ ПЕПТИДИЛ-а-АМИНОАЛЬДЕГИДОВ
/V-Защищенные а-аминоальдегиды и пептидил-а-аминоальдегиды - обычно бесцветные кристаллы или масла. Они хорошо растворимы в органических растворителях, относительно нестабильны как химически, так и конфигурационно, особенно в растворе. По этой причине для доказательства структуры пептидальдегидов чаще всего используют метод 'Н-ЯМР: протону СНО-группы отвечает сигнал при 8 9.5—10 м.д. Пептидил-а-аминоальдегиды, как и а-аминоальдегиды, легко раце-мизуются, особенно при контакте с силикагелем, который часто используют для очистки этого класса соединений методом флаш-хроматогра-фии. Механизм рацемизации yV-защищенных а-аминоальдегидов (I) на силикагеле включает стадии протонирования (II) и енолизации (III) (схема 1) [20].
Оптическая стабильность некоторых /V-защи-щенных а-аминоальдегидов при хроматографии на силикагеле была впервые изучена Ито и соавт. [20]. В соответствии с их данными, Z-L-a-аминоаль-дегиды можно расположить в порядке уменьшения склонности к рацемизации на силикагеле следующим образом: Z-S-Bzl-L-цистеиналь §> Z-L-фенил-аланиналь > Z-L-лейциналь > Z-A^-HHTpo-L-apra-ниналь. Следует отметить, что альдегиды с R'-группой, стабилизирующей енольную форму, например г-^-Вг^-цистеиналь, рацемизуются при контакте с силикагелем наиболее быстро. Добавление 0.1% пиридина к элюирующей системе растворителей позволяет значительно уменьшить потерю оптической активности [21].
Пептидиларгининали и пептидиллизинали,кроме енольной и свободной альдегидной форм, имеют циклическую форму. Именно с существованием циклической карбиноламинной структуры (V), которая препятствует процессу рацемизации, авторы связывают относительную оптическую устойчивость 7,-Л/С-нитро-£-аргининаля (схема 2) [20]. Таким образом, оптическая лабильность а-амино-
альдегидов в значительной мере зависит от их структуры.
Существенное понижение температуры хранения а-аминоальдегидов способствует сохранению конфигурации этих соединений. Так, при -30°С Вос-Ь-Ееиа1 практически не рацемизуется в течение 9 сут, в то время как при комнатной температуре в течение такого же периода времени это соединение рацемизуется на 30% [22].
Для сохранения оптической активности а-ами-ноальдегиды превращают в более стабильные производные (семикарбазоны [23, 24], имидазо-лидины [25] или ацетали [26]), которые очищают хроматографией, а затем удаляют защитные группы с альдегидной функции.
2. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ СИНТЕЗА ПЕПТИДИЛ-а-АМИНОАЛ ЬДЕГИ] (ОБ
Для синтеза пептидил-а-аминоальдегидов наиболее часто используют два возможных пути. Один из них заключается в конденсации защищенных по карбонильной группе производных аминоальдегидов и ацилпептидов с последующим высвобождением альдегидной группы, второй основан на окислении пептидил-(3-аминоспиртов.
Существует довольно много химических методов получения а-аминоальдегидов, хотя все их можно свести либо к реакциям восстановления, либо к реакциям окисления. Большинство из этих методов подробно описаны в книге "Модифицированные аминокислоты и пептиды на их основе" под редакцией Чипенса [27], а более поздние работы суммированы в литературном обзоре диссертации Потетиновой [28].
2.1. Конденсация производных а-аминоальдегидов с эфирами Ы-защищенных аминокислот и пептидов
а-Аминоальдегиды, полученные химическими или ферментативными методами и защищенные по карбонильной группе, могут применяться в пептидном синтезе. Для получения пептидальде-гидов чаще всего в качестве аминокомпонента используют ацетали или семикарбазоны аминоальдегидов. Например, №-2-./Ус-нитро-/,-аргини-наль превращали в семикарбазон [23], затем удаляли 7-защиту НВг в уксусной кислоте. Полученный семикарбазон Л/°-нитро-/,-аргининаля (VI) вводили в реакцию с УУ-оксисукцинимидным эфиром Z-L-лейцина (схема 3). Разлагая семикарбазон г^-лейцил-Л^-нитро-Ь-аргининаля (VII) формалином в солянокислом растворе, получали Х-Ь-лей-цил-Л/°-нитро-1,-аргининаль (VIII) с выходом более 60%.
По аналогичной методике из соответствующих ЛЧжсисукцинимидных эфиров ацилированных ди-
HNZ Н
NH N1 ГЖ)2
но Y
N ,/NHNO-,
Т "
NH
ZNH
(IV)
(V)
Схема 2. Таутомерные формы Z-A^-miTpo-L-apriiHn-наля [20].
пептидов и семикарбазона аргининаля синтезировали лейпептины Ac-Leu-Leu-Argal (Ac-LL), Pp-Leu-Leu-Argal (Pp-LL) и их аналоги, содержащие валин или изолейцин вместо одного или двух остатков лейцина [24]. Следует подчеркнуть, что некоторые авторы при синтезе пептидальдегидов предпочитали получать производные аргининаля, расщепляя природный лейпептин, предварительно прев
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.