Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2005, том 31, № 6, с. 586-592
УДК 577.112.6:577.152.34435
СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ В ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ СУБТИЛИЗИНА 72,
ИММОБИЛИЗО ВАННОГО НА КРИОГЕЛЕ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА
© 2005 г. А, В. Беляева*, А. В. Бачева**, Е. С. Оксенойт**, Е. Н. Лысогорская**,
В. И. Лозинский*, И. Ю. Филиппова***
*Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва; **Химический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
119992, Москва, В-234, Воробьевы горы Поступила в редакцию 14.01.2005 г. Принята к печати 14.04.2005 г.
Сериновая протеиназа субтилизин 72 (КФ 3.4.21.14), иммобилизованная на криогеле поливинилового спирта, была использована в качестве катализатора в синтезах УУ-защищенных м-нитроанилидов пептидов общей формулы Z/Boc-Xaa-Phe-pNA (Хаа = Leu, Ala), Z-Ala-Xaa-Yaa-pNA (Хаа = Leu, Ala; Yaa = Leu, Phe), Z-Ala-Ala-Xaa-Yaa-pNA (Xaa = Leu, Arg, Gly; Yaa = Phe, Leu, Gly, Asp, Glu), проводимых в смесях диметилформамид-ацетонитрил. Получен ряд защищенных ди-, три- и тетрапептидов с выходом до 99%. Установлено, что стереоселективность синтеза в исследованных условиях сохраняется. Показано, что активация карбоксильной группы ацилирующего компонента оказывает позитивное влияние на скорость конденсации.
Ключевые слова: субтилизин иммобилизованный; криогелъ поливинилового спирта; пептидный синтез, ферментативный.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что ценные сведения о каталитических свойствах гидролитических ферментов в среде органических растворителей можно получить при изучении катализа реакций этерификации и переэтерификации [1-4]. В случае протеолитиче-ских ферментов - это катализ реакций расщепления и образования пептидных связей. При этом кинетически контролируемый пептидный синтез [5], катализируемый сериновыми протеиназами, успешно протекает в безводных или почти безводных средах. Значительную инактивацию про-теиназ обычно можно предотвратить, используя их в виде суспензии или в иммобилизованном виде [6, 7]. Ковалентная иммобилизация - это один из наиболее эффективных методов стабилизации данных ферментов от инактивирующего действия смесей полярных органических растворителей с низким содержанием воды. В частности, было показано, что иммобилизация сериновой протеиназы субтилизин 72 на криогеле поливинилового спирта (ПВС) (макропористый гель, образующийся в ре -
Сокращепия: рЫА - н-питроанилид; РИС1 - хлорфенил; Сат - карбамоилметил, -СНо-СО-М^Ь: 8Ы(111 - иммобилизованный субтилизин; ССР - стандартная смесь растворителей ОМИ/МеСЫ, 60 : 40 (по объему). "Автор для переписки (тел.: (095)" 9395529; факс: (095) 9328846; эл. почта: irfilipp@genebee.msu.su).
зультате замораживания-оттаивания водного раствора ПВС [8]) достаточно эффективно стабилизирует фермент для работы в таких условиях [9]. Цель данной работы - поиск оптимальных условий ферментативного синтеза пептидов, катализируемого иммобилизованным субтилизином (8ЫШ1), в органической среде, выяснение влияния активации карбоксильной группы ацилирующих агентов на скорость образования продукта в выбранных условиях и расширение диапазона синтезируемых соединений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ранее [10] на примере модельной реакции
г-А1а-А1а-Ьеи-ОСН, + РЬе-рЫА
(1)
г-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рЫА + СН3ОН,
катализируемой субтилизином 72, иммобилизованным на криогеле ПВС, при исследовании зависимости эффективности пептидного синтеза от соотношения ОМР/МеСИ в реакционной среде было установлено, что в диапазоне концентраций 30-80% ЭМЕ реакция протекает наиболее эффективно. Поэтому в данной работе все синтезы, катализируемые иммобилизованным субтилизином, проводили при соотношении ЭМИ/МеСЫ, равном 60 : 40
(об.%) (здесь, и далее - стандартная смесь растворителей, ССР), как наиболее оптимальном и для активности биокатализатора, и для растворимости исходных соединений. Реакции проводили при эквимолярном соотношении амино- и карбоксильного компонентов (в дальнейшем под концентрацией исходных компонентов будет иметься в виду парциальная концентрация амино- и карбоксильного компонентов), а соотношение фермент-субстрат варьировали от 1 : 6000 до 1 : 25600 (здесь, и далее моль/моль).
Было исследовано влияние концентрации исходных реагентов на скорость образования продукта пептидной конденсации на примере модельной реакции (1), катализируемой иммобилизованным субтилизином, в диапазоне концентраций субстратов 0.5-200 мМ (рис. 1). Концентрация фермента оставалась постоянной и составила 7.8 мкМ. Из диаграммы видно, что чем выше концентрации исходных реагентов, тем выше скорость образования продукта. Так, разница выходов через 5 мин и 20 мин для концентрации субстратов 2 мМ и 200 мМ составила 18 и 30%, соответственно. Таким образом, для наиболее эффективного проведения синтезов желательно использовать максимально высокие концентрации субстратов (подразумевается, что максимально возможно высокие концентрации субстратов ограничены их растворимостью).
Одним из преимуществ ферментативного пептидного синтеза является его строгая стереосе-лективность. Однако в органической среде не исключены некоторые изменения пространственной структуры зоны связывания активного центра фермента, поэтому важным представлялось проверить, сохраняется ли стереоспецифичность реакций в используемых нами условиях. Известно [11, 12], что в ряде случаев возможно катализируемое субтилизином образование пептидной связи между аминокислотными остатками, один из которых находится в О-конфигурации. Так, Черов-ски и сотр. [11] было показано, что в случае больших избытков аминокомпонента, содержащего О-аминокислоту, возможно образование продукта конденсации, катализируемой субтилизином Карлсберг в органической среде.
С целью проверки стереоспецифичности ферментативного синтеза, катализируемого субтилизином, иммобилизованным на криогеле ПВС, мы провели реакции, аналогичные модельной, используя амино- и ацилкомпоненты, содержащие в
и Р\ -положении остатки О-аминокислот вместо соответствующих ¿-аминокислот:
г-А1а-А1а-0-Ьеи-ОСН3 + РЬе-р^
8ы„,
ЯЫ:,
Выход, %
90 -
80 -
70 -
60 -
50 -
40 - ■
30 -
20
10
0 ■
□ 5 мин И 10 мин 20 мин
0.5 2.0 10
30 100 200 [Б], мМ
г-А1а-А1а-Ьеи-ОСН3 + О-РЬе-рЫА
С использованием /7-нитроанилида £>-амино-кислоты даже через трое суток не было отмечено
Рис. 1. Зависимость от концен трации исходных веществ выхода г-А1а-А1а-Ьеи-Р1")е-рЫА через 5, 10 и 20 мин.
появления продукта реакции, что свидетельствовало о сохранении стереоселективности фермента при эквимолярном соотношении исходных реагентов в безводной органической среде.
В условиях, подобранных для модельной реакции, с помощью иммобилизованного субтилизина с достаточно высокими выходами был синтезирован ряд ди- и трипептидов (табл. 1). Реакции проводили при начальной концентрации исходных реагентов 100 мМ и в ряде случаев 200 мМ.
На примере синтезов пептидов (1)~(5) было исследовано влияние длины ацилирующего компонента (числа аминокислотных остатков, входящих в его состав) на скорость образования продукта реакции. Действительно, длина ацилирующего компонента даже в условиях высоких концентраций субстрата оказывала заметное влияние на эффективность синтеза. Так, аналитический выход защищенного дипептида 2-Ьеи-РЬе-рЫА (1) через 19 ч составил 76%, а защищенного трипептида 2-А1а-Ьеи-Р11е-рЫА (4) уже через полчаса - 98% при концентрации начальных реагентов 100 мМ. Синтез дипептида (1) удалось также провести и при более высокой концентрации исходных реагентов - 200 мМ, в этом случае выход продукта составил 77% за 2 ч (данные не приведены в таблице), что косвенным образом свидетельствует о том, что концентрация исходных реагентов играет решающую роль на скорость образования конечного продукта. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными по синтезу пептидов с помощью субтилизина, адсорбированного на целите [13]. Согласно этим данным, более длинные пептидные фрагменты легче синтезируются субтилизином, что можно предположить из данных работы [14], согласно которым этот фермент обладает достаточно протяженным центром связывания. В случае использования субтилизина, иммобилизованного на криогеле ПВС, сохраняются те же закономерности.
588 БЕЛЯЕВА и др.
Таблица 1. Пептиды, синтезированные с помощью субтилизина 72, иммобилизованного на криогеле ПВС
Карбоксильный компонент Аминоком-понент Продукт реакции Время реакции,ч Содержание, %
Структура Номер
Z-Leu-OMe Phe-pNA Z-Leu-Phe-pNA (1) 19 76
Boc-Leu-OCam To же Boc-Leu-Phe-pNA (2) 2 99
Boc-Ala-OCam » Boc-Ala-Phe-pNA (3) 0.5 99
Z-Ala-Leu-OMe » Z-Ala-Leu-Phe-pNA (4) 0.5 98
Z-Ala-Ala-OMe Leu-pNA Z-AIa-Ala-Leu-pNA (5) 2 94
Z-Ala-Ala-Leu-OH Phe-pNA Z-A!a-Ala-Leu-Phe-pNA (6) 1 63
Z-Ala-Ala-Leu-OMe To же » (6) 1 93
Z-Ala-Ala-Arg-OH » Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA (7) 24 26
Z-Ala-Ala-Arg-OMe » » (7) 24 82
Z-Ala-Ala-Arg-OMe Glu-pNA Z-Ala-Ala-Arg-Glu-pNA (8) 24 87
Z-Ala-Ala-Arg-OMe Asp-pNA Z-A la-Ala-Arg-Asp-pNA (9) 24 34
Z-Ala-Ala-Lys-OH Phe-pNA Z-Aki-Ala-Lys-Phe-pNA (10) 2 90*
Z-Ala-Ala-Glu-OH » Z-Ala-Ala-Glu-Phe-pNA (11) 2 98*
Z-Ala-Ala-Lys-OH Asp-pNA Z-Ala-Ala-Lys-Asp-pNA (12) 2 98*
Z-Ala-Ala-Glu-OH » Z-Ala-Ala-Glu-Asp-pNA (13) 4 74*
Z-AIa- Ala-Gly-OMe Phe-pNA Z-Ala-Ala-Gly-Phe-pNA (14) 2 56
Z-Ala-Ala-Leu-OMe Gly-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Gly-pNA (15) 2 70
* Данные работы [10]. Условия реакций: DMF/MeCN 60 : 40 об. %, [Е] 7.8 мкМ, [S] 100 мМ для продуктов (1-4), 200 мМ для (5-7), 150 мМ для (8, 9), 30 мМ для (10-13) и 50 мМ для (14,15), +20°С.
Влияние активации карбоксильной группы на ход синтеза было исследовано на примере синтеза дипептидов (1) и (2). Как и ожидалось, реакции с участием карбамоилметиловых эфиров протекают быстрее, чем при использовании метиловых эфиров. Так, выход дипептида (2) при использова-
Выход, %
I, мин
Рис. 2. Синтез 7-А1а-А1а-Ьеи-РИе-рК'А в ССР, катализируемый иммобилизованным субтилизином, при использовании п качестве карбоксильных компонентов г-А1а-А1а-Ьеи-ОМе (/) и г-А1а-А1а-1хи-ОН (2), концентрации исходных реагентов 200 мМ, |Е| : [8| = = 1 : 25600.
ни
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.