ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 5, с. 628-637
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
СИСТЕМНАЯ ЗАЩИТА РИСА ОТ ПИРИКУЛЯРИОЗА ИНГИБИТОРАМИ
АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ © 2015 г. А. А. Аверьянов*, Т. Д. Пасечник*, В. П. Лапикова*, Т. С. Романова*, К. Дж. Бейкер**
*Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт
фитопатологии, Большие Вязёмы, Московская обл.
**Лаборатория молекулярной патологии растений, Служба сельскохозяйственных исследований Департамента
сельского хозяйства США, Белтсвил, Мериленд, США Поступила в редакцию 25.02.2015 г.
Системная приобретенная болезнеустойчивость растений (СПУ) может быть результатом окислительного взрыва в их тканях, вызванного как усилением продукции АФК, так и ослаблением антиокислительной активности, в частности ферментативной. В настоящей работе проверено, могут ли экзогенные ингибиторы супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ), соответственно, диэтилди-тиокарбамат (ДДК) и аминотриазол (АТ) системно защищать рис (Oryza sativa L.) от пирикуляриоза (возбудитель - гриб Magnaporthe oryzae Conouch et Kohn). Исследовано также возможное участие АФК в этой защите. Обнаружено, что ДДК не влиял на прорастание спор гриба, а АТ частично тормозил его. Оба вещества не были токсичны для растения и при нанесении на 4-й лист значительно ослабляли симптомы болезни на зараженном 5-м листе. Защитное действие АТ, очевидно, зависело от присутствия перекиси водорода, поскольку ослаблялось перехватчиком Н2О2 диметилтиомочевиной, нанесенной на тот же лист после АТ, а экзогенная Н2О2, нанесенная вместо АТ, защищала от болезни. Эндогенная перекись могла накапливаться вследствие ингибирования КАТ, которое действительно наблюдалось в листьях, обработанных АТ. Обработка 4-го листа раствором ДДК или АТ стимулировала образование супероксидного радикала в диффузате зараженного 5-го листа по сравнению с обработкой водой, указывая на возможность участия АФК в системных защитных реакциях. В тех же диффу-затах усиливалась фунгитоксичность, которая ослаблялась, если в диффузаты добавляли антиокси-данты. Таким образом, ингибиторы антиокислительных ферментов системно ослабляли пирикуляри-оз риса, возможно, при посредстве СПУ. В механизмах индукции СПУ (в обработанном листе), как и при реализации СПУ (в системно защищенном листе) могли участвовать АФК.
Ключевые слова: Oryza sativa — Magnaporthe oryzae — активные формы кислорода — каталаза - суперок-сиддисмутаза - аминотриазол — диэтилдитиокарбамат — пирикуляриозриса — системная приобретенная болезнеустойчивость
DOI: 10.7868/S001533031505005X
ВВЕДЕНИЕ
Системная приобретенная устойчивость (СПУ) к болезням появляется у восприимчивых растений в ответ на некоторые воздействия так называемых индукторов. СПУ распространяется по растению и реализуется при последующем заражении на отдаленных участках [1]. Локальная гибель растительных клеток, вызванная физическими факторами [2], интоксикацией [3, 4] или сверхчувствительной
Сокращения: АТ — аминотриазол; ДДК - диэтилдитиокарбамат; ДМТМ — диметилтиомочевина; КАТ - каталаза; СОД — супероксиддисмутаза; СПУ — системная приобретенная устойчивость; 02 - супероксидный радикал. Адрес для корреспонденции: Аверьянов Андрей Александрович. 143050 Большие Вязёмы, Московская обл. Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии. Электронная почта: andrey.a.averyanov@yandex.ru
реакцией на заражение авирулентными патогенами [5], служит частой причиной индукции СПУ. Другая причина — локальная избыточная продукция АФК ("окислительный взрыв"), которая связана, хотя и не обязательно, с гибелью клеток [6].
Окислительный взрыв, системно защищаю -щий от болезней, можно вызвать несколькими способами, например, внесением АФК или воздействием источников АФК извне. Так, в частности, действует экзогенная перекись водорода [6]. Гербицид паракват восстанавливает молекулярный кислород до супероксида за счет электрон-транспортных цепей, а рибофлавин — за счет фотоокисления метионина [7]. Соответственно, оба соединения системно защищают растения огурца от антракноза [3] и риса от пирикуляриоза [8]. Аналогичную защиту от вирусной мозаики табака
[9] и оливковой пятнистости огурца [10] оказывают фотодинамические красители, образующие на свету синглетный кислород. Многие вещества, например, элиситоры, стимулируют эндогенные источники АФК, приводя в итоге к формированию системной устойчивости [11].
Уровень АФК повышается не только при их усиленном образовании, но и при ослабленном разрушении. Второе происходит при ингибирова-нии антиокислительных систем, в частности ферментативных. Например, одним из механизмов противоинфекционного действия салициловой кислоты считается ингибирование ею растительной каталазы, ведущее к накоплению перекиси водорода. Аналогичный механизм предполагается для действия экзогенной изоникотиновой кислоты и бензотиадиазола [12]. Не исключено, что и другие ингибиторы антиокислительных ферментов способны повышать болезнеустойчивость растений, в том числе и системно.
Хорошо известны ингибитор С^п-суперок-сиддисмутазы (СОД) диэтилдитиокарбамат (ДДК) и ингибитор каталазы (КАТ) 3-амино-1,2,4-триа-зол (АТ) [7]. Их производные широко применяются в растениеводстве. Дитиокарбаматы служат действующим началом многих фунгицидов [13], а карбаматы — нескольких гербицидов [14]. Мы обнаружили локальную защиту листьев риса от пи-рикуляриоза при опрыскивании их раствором ДДК [15]. Кроме того, радикал триазола является частью молекулы ряда фунгицидов [13], а сам АТ известен как гербицид Амитрол [14].
Мы не нашли литературных свидетельств системной устойчивости, вызванной именно ДДК или АТ В наших предварительных опытах таковая была выявлена при оливковой пятнистости огурца (возбудитель — гриб Cladosporium cucumerinum) [16], однако механизм защиты пока неясен. Возможно, он связан с фитотоксичностью обоих веществ и (или) их способностью вызывать накопление АФК.
В системно защищенной зоне растения СПУ реализуется в разнообразных защитных реакциях. Их набор включает вторичный окислительный взрыв [6, 17], в котором АФК действуют и как сигнальные молекулы, и как непосредственные токсиканты. В частности, трициклазол или про-беназол, внесенные в почву, защищают листья риса от пирикуляриоза. При этом усиливается генерация супероксидного радикала (02) в диф-фузате листьев (как здоровых, так и зараженных) и токсичность диффузата для спор возбудителя, которая ослабляется антиоксидантами и тем самым зависит от АФК [18]. Те же явления, но только на зараженных листьях, сопровождают защиту от пирикуляриоза фенантролиновым комплексом кобальта, внесенным в почву [19]. Рибофлавин или розеофлавин, добавленные в почву [8],
или фталоцианиновые металлокомплексы при обработке ими семян [20] тоже защищают листья риса и стимулируют АфК-зависимую фунгиток-сичность их диффузатов.
Целью настоящей работы являлась проверка предполагаемой способности ДДК или АТ, нанесенных на листья риса, вызывать СПУ и защищать листья более высокого яруса от пирикуля-риоза. Мы также попытались выяснить, связана ли такая защита с АФК в обработанных и системно защищенных листьях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Растения риса (Oryza sativa L.) сорта Sha-tiao-tsao (ген устойчивости Pi-ks) [21] выращивали в климатической камере, как описано ранее [22].
Грибной материал. Культуру Magnaporthe oryzae Conouch et Kohn (вирулентный штамм Н5-3, раса 007, гены вирулентности Av-ks+, Av-a+ и Av-i+) поддерживали на агаризованном морковном отваре. Суспензию спор получали добавлением воды к 7-10-суточному мицелию, как и ранее [22].
Обработка растений. Четвертые (верхние) листья интактных проростков (21-27 суток) помещали в инокуляционную камеру [23]. На верхнюю поверхность этих листьев наносили воду, 0.001 мМ диэтилдитиокарбамат натрия ("Serva", Германия) или 0.1 мМ 3-амино-1,2,4-триазол ("ICN", США) по 6 капель на лист (по 20 мкл в каждой капле) с помощью капледержателей [23], после чего растения оставляли в климатической камере.
Чтобы показать участие Н2О2 в индукции болезнеустойчивости аминотриазолом, последний комбинировали с диметилтиомочевиной (ДМТМ, "Sigma", США) — перехватчиком перекиси водорода [24]. Капли ДМТМ помещали в те же точки 4-го листа за сутки до АТ, либо через сутки после АТ. Капли, нанесенные первыми, удаляли с помощью фильтровальной бумаги. В других опытах вместо АТ наносили 10 мМ Н2О2 ("Merck", Германия).
Инокуляция растений. Когда появлялся 5-й лист (через 8-10 дней после обработки), его инокулиро-вали суспензией 105 спор/мл (или водой в контроле), которую наносили тем же способом, что и испытуемые вещества. Растения выдерживали 2224 ч в темноте при 23°C, затем возвращали в освещенную климатическую камеру.
Оценка визуальных изменений. Через 18-20 дней после обработки подсчитывали, какая доля (%) капель, нанесенных на каждый четвертый лист, вызывала повреждения. Последние называли "ожогами", чтобы отличать от инфекционных пятен.
На пятых листьях через 10 дней после заражения оценивали симптомы болезни. Для этого под-
считывали количество капель инокулюма (%), оставивших пятна совместимого типа (типы 4 и 5, признак восприимчивости), несовместимого типа (типы 1-3, признак устойчивости) или не оставивших симптомов (тип 0, признак устойчивости) [25].
Каталазную активность листьев анализировали
по скорости распада экзогенной перекиси водорода [26]. На четвертые листья помещали капли воды или 0.1 мМ AT (как описано выше), которые через сутки удаляли фильтровальной бумагой. Контактировавшие с каплями участки листьев (длиной 6 см, по 8 листьев на вариант) вырезали, промывали водой и все вместе растирали в агатовой ступке в холодном 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.0 (25 мг/мл). Гомогенат центрифугировали 10 мин при 14 000 g. Смешивали 0.1 мл супернатан-та, 1.8 мл раствора 18-20 мМ Н2О2 в том же буфере и 0.1 мл воды. Измеряли скорость снижения ^240 при 25°C на спектрофотометре UV-2501PC ("Shi-madzu", Япония). Удельную активность рассчитывали на белок, который анализировали по Bradford [27]
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.