ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 3, с. 342-348
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575:591.48:591.51
СИСТЕМНЫЙ КОНТРОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ДОЛГОСРОЧНЫХ
ПОСЛЕДСТВИЙ СТРЕССА
© 2009 г. А. И. Вайдо, Н. А. Дюжикова, Н. В. Ширяева, Н. Е. Соколова,
В. В. Вшивцева, Ю. Н. Савенко
Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук, Санкт-Петербург 199034;
e-mail: shiryaeva@kolt.infran.ru Поступила в редакцию 14.05.2007 г. Окончательный вариант получен 28.08.2007 г.
В рамках представлений М.Е. Лобашева о системном контроле генетических и цитогенетических процессов и существенном влиянии возбудимости на ход пластических изменений в ЦНС проведено исследование влияния длительного эмоционально-болевого стресса (ДЭБС) на молекулярно-кле-точные и эпигенетические механизмы травматической памяти у селектированных по возбудимости нервной системы линий крыс. Впервые показано, что под влиянием ДЭБС происходят длительные (2 мес.) морфологические альтерации поля CA3 гиппокампа и модификации активности генома пирамидных нейронов, входящих в его состав. Оба феномена потенцируются сниженным генетически детерминированным функциональным состоянием ЦНС. Процесс постстрессорной регуляции функционирования генома нейронов гиппокампа опосредуется изменением конформации гетеро-хроматина, последовательной активацией синтеза белка MeCP2 и изменением уровня ацетилирова-ния гистона Н4. Генетически детерминированная возбудимость нервной системы является фактором риска, определяющим специфику и временную динамику наблюдаемых молекулярно-клеточ-ных и генетических трансформаций нервных клеток. Полученные данные могут способствовать более углубленному пониманию эпигенетических механизмов так называемой "памяти стресса", являющейся патогенетической базой посттравматического стрессорного расстройства и других психогений человека, характеризующихся длительным течением.
В настоящее время хорошо известно, что стресс вызывает не только кратковременные, но и долгосрочные нарушения поведения животных и человека [1, 2]. В частности, у человека последствия стресса проявляются при возникновении посттравматического стрессового расстройства -комплекса длящихся зачастую всю жизнь психических, физиологических и нейроэндокринных нарушений. Механизмы его возникновения и длительного течения неизвестны. Теоретически можно предположить, что в основе возникновения посттравматического стрессорного расстройства (ПТСР) лежат нарушения морфологии мозга и изменения механизма эпигенетического контроля функционирования генома нейронов. Разнообразие индивидуальных реакций на стресс чрезвычайно велико. В свете гипотезы системного контроля генетических и цитогенетических процессов М.Е. Лобашева постулированные изменения, вероятно, находятся в зависимости от генетически детерминированной функциональной активности нервной системы организма. Цель нашей работы - сравнительно-генетический анализ молекулярно-клеточных и эпигенетических механизмов долгосрочных влияний длительного эмоционально-болевого стресса
(ДЭБС) на гиппокамп - полимодальную структуру мозга, отвечающую, в частности, за обучение, эмоции, внимание и чрезвычайно чувствительную к действию экстремальных факторов внешней среды [3].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили две линии крыс, селектированные в лаборатории генетики высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН по возбудимости нервной системы [4] и качественно различающиеся по стрессреактивности, динамике и длительности постстрессорных изменений поведения [5, 6]. Эксперименты проводили на 5-месячных самцах селектированных линий крыс с максимальными различиями по порогам возбудимости - высокий порог (ВП1) и низкий порог (НП2).
Метод ДЭБС. В качестве экспериментального воздействия, вызывающего длительные изменения функционирования мозга и поведения, применяли эмоционально-болевое стрессирование, повторяющееся в течение 15 дней, ежедневно по 13 мин: подача шести неподкрепляемых (10 с) и шести подкрепляемых током (2.5 мА, 4 с) свето-
вых сигналов по стохастической схеме К. Гехта [7] с вероятностью подкрепления 0.5. Сигналы подавались в прозрачную камеру с электрифицированным полом с одноминутным межсигнальным интервалом. По окончании 15-дневной процедуры стрессирования опытных и контрольных животных забивали декапитацией через сутки, 2 нед и 2 мес.
Метод анализа планиметрической плотности нейронов поля СА3 гиппокампа. Всего в опытах использовано 60 крыс. В выбранные сроки после ДЭБС опытных и контрольных (интакт-ных) крыс по 5 особей в каждой группе декапити-ровали. Затем на льду вскрывали череп, извлекали мозг, отделяли передний отдел - полушария головного мозга с гиппокампом и частью среднего мозга и три часа фиксировали мозг в растворе Карнуа с последующей проводкой и заливкой в парафин. Далее делали серийные фронтальные срезы (7 мкм), расправляли их на устройстве для сушки парафиновых срезов, наклеивали белком куриного яйца с глицерином на предметные стекла, высушивали и окрашивали по Бемеру. Затем заключали в канадский бальзам и изучали под световым микроскопом пирамидный слой гиппо-кампа, для которого характерны крупные ядра нейронов круглой формы относительно прозрачные из-за мелкодисперсного состояния хроматина с одним-двумя крупными ядрышками (в отличие от окружающих этот слой чаще удлиненных мелких ядер глии с концентрированным хроматином и многочисленными ядрышками). Определяли число пирамидных нейронов в поле СА3 гип-покампа на единицу площади. За единицу площади была принята стандартная рамка размером 3600 мкм2. Проведено изучение 20 срезов (в среднем по 150 нейронов) на каждое животное. Статистическую обработку осуществляли по i-крите-рию Стьюдента.
Метод определения содержания гетерогенной ядерной РНК. Через сутки, 2 нед. и 2 мес. после окончания стрессирования крыс контрольных и опытных групп декапитировали, выделяли отдел головного мозга с гиппокампом, фиксировали по методу Бродского и готовили парафиновые срезы (7 мкм), с последующей окраской галло-цианин-хромовыми квасцами. Содержание РНК определяли цитоспектрофотометрическим дву-хволновым методом в ядрах пирамидных клеток поля СА3 гиппокампа на микроскопе-фотометре МЦФУ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием i-критерия Стью-дента.
Метод анализа площади прицентромерного С-гетерохроматина. В определенные сроки после ДЭБС препарировали мозг декапитирован-ных животных стандартным способом, извлекали гиппокамп, отделяли от него участок, соответ-
ствующий полю СА3. Выявление интерфазного С-гетерохроматина (конститутивный, прицен-тромерный) в изолированнных ядрах нейронов поля СА3 гиппокампа осуществляли на высушенных препаратах с помощью дифференциального окрашивания по модифицированному методу Самнера [8]. Для обработки, анализа и накопления цитогенетических данных использовали информационную систему, разработаннyю на основе модели зрительной адаптивной сегментации изображений [9]. Система производит выделение ядер нейронов из совокупности ядер нервных и глиальных клеток на основе морфометрических параметров (геометрические характеристики и площадь ядра). Выделение и измерение районов гетерохроматина идет на основе характеристик оптической плотности. Система формирует связанные таблицы данных, включающие результаты сегментации и измерений (графические и текстовые объекты) и обеспечивает экспорт матриц измерений в программы статистического анализа. Анализировали общую площадь хромоцен-тров, распределение по степени конденсации, относительную оптическую плотность, расположение относительно условных осей координат. В данной работе представлены результаты анализа общей площади хромоцентров, соответствующих по оптическим свойствам районам гетерохроматина. В каждом варианте использовано не менее пяти животных, от каждого животного получено по два препарата, проанализировано не менее 50 ядер с каждого препарата. Средние величины площади ядер в группах статистически не различались. Проверку материала на однородность осуществляли при помощи однофакторного дисперсионного анализа. Для сравнения результатов использовали критерий i-Стьюдента.
Метод определения содержания метилцито-зин-связывающего белка MeCP2 и гистона Н4. Эвтаназию животных и фиксацию материала осуществляли через 24 ч, 2 нед. и 2 мес. после окончания воздействия. Содержание соответствующих белков гиппокампа изучали с использованием DAB-ABC-иммунопероксидазного метода окрашивания. Для этого использовали DAB-ABC-Elite Kit (mouse/rabbit/goat) (Vector Laboratories). После депарафинизации и процедуры вскрытия антигенов осуществляли подавление пероксидазной активности путем инкубации срезов в течение 30 мин в 0.3%-ном растворе перекиси водорода, далее осуществляли блокировку срезов в нормальной сыворотке (rabbit normal serum) и инкубацию с первичными антителами к МеСР2 (goat MeCP2 (C-17)) и с первичными антителами к ацетильным группам гистона Н4 (goat pan-acetyl(C4) IgG) в разведении 1 : 200, далее последовательная инкубация срезов с биотинилирован-ным антителом и АВС-комплексом (rabbit-anti-goat IgG). После этого следовали окрашивание
Таблица 1. Плотность расположения нейронов в поле СА3 гиппокампа крыс линий ВП1 и НП2 в разные сроки после окончания ДЭБС
Линия, вариант Через 24 ч Через 2 нед. Через 2 мес.
ВП1:
контроль 12.50 ± 0.48 11.30 ± 0.34 13.15 ± 0.5
опыт 10.65 ± 0.20* 9.13 ± 0.66* 9.82 ± 0.2*
НП2: контроль опыт 8.42 ± 0.38 7.70 ± 0.40 7.00 ± 0.21 7.10 ± 0.23 7.71 ± 0.22 6.79 ± 0.14*
* Различия между контрольной и опытной группами в линии достоверны, Р < 0.05.
при помощи DAB набора (Vector Laboratories) и контрокрашивание гематоксилином с последующим заключением препаратов в среду DPX и анализ на световом микроскопе. В каждой экспериментальной группе использовалось не менее пяти животных. От каждого животного приготовлена серия срезов. Подсчитывалось не менее 25 клеток с каждого среза (не менее 100 клеток на препарат). В МеСР2-положительных или Ш-позитив-ных ядрах учитывали количество меток на одно ядро. Результаты обрабатывались с испо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.