ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 434, № 4, с. 562-566
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 577.112.6: 578.82/.83: 615.281.8
СКРИНИНГ EX VIУO ПЕРСПЕКТИВНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ: НОВЫЕ ПОДХОДЫ
© 2010 г. Л. А. Андреева, М. В. Мезенцева, И. Ю. Нагаев, И. М. Шаповал, В. Э. Щербенко, Л. А. Потапова, Л. И. Руссу, А. Н. Наровлянский, Ф. И. Ершов, академик Н. Ф. Мясоедов
Поступило 12.05.2010 г.
Несмотря на широкий арсенал препаратов для терапии различных заболеваний, проблема лечения многих из них все еще остается трудно решаемой задачей. Поэтому крайнюю важность приобретает создание новых противоинфекционных лекарственных средств и изучение механизмов их действия, что предполагает проведение исследований in vitro, in vivo и ex vivo на различных моделях для предварительной оценки их эффективности с возможной экстраполяцией полученных результатов на организм человека.
Одним из наиболее перспективных классов физиологически активных соединений для создания подобных препаратов являются пептиды. Пептиды выполняют в организме разнообразные регуляторные функции, в том числе связанные с реакцией организма на вирусные инфекции, и при этом практически лишены побочных негативных эффектов [1].
В последние годы открыты новые подтипы Т-клеток, которые изменили наши представления об иммунной регуляции и иммунопатологии. Различные подтипы Т-клеток (Th1, Th2, Th17, Treg) характеризуются продукцией определенных цито-кинов, которые опосредуют ряд специфических реакций в различных клетках, таких как дендритные клетки, кератиноциты, эпителиальные клетки, эозинофилы, тучные клетки, фибробласты и нейтрофилы [2]. В настоящем исследовании мы остановились на изучении цитокинового спектра мононуклеаров периферической крови (МНПК), характерного, в основном, для Т-хелперов первого и второго типов (Th1 и Th2). Это связано с тем, что Th1- и 1Ъ2-цитокины наиболее хорошо изучены, контролируют направление иммунного ответа и могут определять повышение устойчивости
Институт молекулярной генетики Российской Академии наук, Москва Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук, Москва
организма и его клеток к инфекциям бактериального и вирусного происхождения.
Известно, что ТЫ-лимфоциты продуцируют ИФН-у и стимулируют клеточный иммунитет; ТЬ2-лимфоциты продуцируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и активируют гуморальный иммунитет; Тге§-лимфоциты секретируют ИЛ-10 и ТОБ-р и супрессируют иммунный ответ; ТЫ7-лимфоци-ты характеризуются экспрессией ИЛ-17, ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-22 и играют большую роль в развитии аутоиммунной патологии. В-лимфоциты синтезируют ИФН-а, ИЛ-1р, ИЛ-12, моноциты/макрофаги - ИЛ-8, ИЛ-18, ФНО-а. Нормальное функционирование иммунной системы таким образом строится на балансе различных подтипов Т-клеток, в том числе и ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов, основанном на равноценной продукции соответствующих регуляторных цитоки-нов, что во многих случаях предопределяет течение и исход заболеваний [3-5]. Активация ТЫ, продуцирующих интерферон ИФН-у, ведет к стимуляции функции Т-лимфоцитов и макрофагов и развитию иммунного ответа по клеточному типу, который играет решающую роль в защите от внутриклеточных возбудителей, включая вирусы. В активации ТЫ принимает участие ИФН-а, синтезируемый в ранней фазе вирусной инфекции, способный индуцировать не только повышенную экспрессию ИЛ-12, но и переключать ТЪ0 с синтеза ТМ-цитокинов на ТЫ. Дифферен-цировку ТЪ0 лимфоцитов в ТЫ регулирует ИЛ-12 [4, 5].
В настоящей работе впервые приводятся данные о влиянии на показатели функциональной активности иммунной системы гептапептида Ме1-О1и-И!5-Рке-Рго-О1у-Рго (семакс) и ряда пептидов, являющихся структурными фрагментами гептапептида ТЬг-Ьуз-Рго-Лг§-Рго-О1у-Рго (селанк), приведенных в табл. 1.
Ранее нами было показано наличие иммуно-модулирующих и противовирусных свойств геп-тапептида ТЬг-Ьуз-Рго-Лг§-Рго-О1у-Рго, селанка [6, 7]. Это явилось основой исследований по выявлению фармакофора, ответственного за эти
СКРИНИНГ EX VIVO ПЕРСПЕКТИВНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ 563
Таблица 1. Изменение синтеза мРНК цитокинов в клетках крови здоровых добровольцев после воздействия пептидов ex vivo
Исследуемые пептиды Появление мРНК цитокинов Исчезновение мРНК цитокинов
Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс) ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-10 ИЛ-4, ФНО-а
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанк) ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12 ИЛ-4
Thr-Lys-Pro-Gly-Pro ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10 ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а
Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro ИЛ-4, ИЛ-10 ФНО-а
Pro-Arg-Pro-Gly-Pro ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-10 Нет изменений
Arg-Pro-Gly-Pro ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-2 ИФН-а, ИЛ-4
Pro-Gly-Pro ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-12 ИФН-а, ИЛ-4
Thr-Lys ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12 ИФН-а, ФНО-а, ИЛ-ф
Thr-Lys-Pro ИЛ-2, ИЛ-12 ИЛ-1Р, ИФН-а
Thr-Lys-Pro-Arg ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-2 ИФН-а, ИЛ-1Р, ИЛ-4
Lys-Pro-Arg ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-2 ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-1Р
Arg-Pro ИЛ-10, ИЛ-12 ИЛ-6, ИЛ-1Р, ФНО-а
Gly-Pro ИЛ-10 ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-1Р, ФНО-а
свойства, и создания на его основе новых пептидов с противоинфекционными свойствами. Первоочередной задачей являлось выделение из аминокислотной последовательности гептапептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro — фармакофора, ответственного за противоинфекционные и имму-номодулирующие свойства, и создание на этой основе кандидатов в новые лекарственные препараты. Такие кандидатные пептиды, проявившие максимальную противовирусную активность в предварительных экспериментах in vitro и in vivo, использовались в настоящем исследовании. В качестве препаратов сравнения выступили хорошо известные и изученные иммуномодуляторы цик-лоферон и ридостин [8].
Для достижения поставленных задач проведено определение ex vivo с использованием ранее разработанного биологического метода — ИФН-статус (расширенный интерфероновый статус) [9—11] потенциального профилактического и терапевтического эффекта синтезированных пептидов в клетках крови здоровых добровольцев, больных гепатитом С, гриппом, герпесной и ци-томегаловирусной инфекциями, а также при туберкулезе, хламидийной и микоплазменной инфекции. Все исследования цитокин-модулирую-щей активности синтезированных пептидов проводили ex vivo на модели мононуклеарных клеток периферической крови больных в соответствии с методическими указаниями [9—11]. Исследовали степень экспрессии генов 11 различных цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-а), которую оценивали по синтезу мРНК методами обратной транскрипции и полимераз-ной цепной реакции (ОТ-ПЦР) [12—15]. Основные группы, кровь которых исследовалась, соста-
вили: 30 больных с диагностированным туберкулезом, 50 пациентов с хламидиозом, 50 больных с диагнозом микоплазмоз (Mycoplasma pneumonia и/или Mycoplasma hominis), 50 больных вирусным гепатитом С (ВГС), 60 больных генитальным герпесом, 30 больных цитомегаловирусной инфекцией, 30 больных гриппом, 120 практически здоровых добровольцев (18—35 лет).
Проведенные исследования показали, что исследуемые пептиды изменяют спектр мРНК ци-токинов, вырабатываемых иммунокомпетентны-ми клетками человека в экспериментах ex vivo. В табл. 1 приведены данные по изменению синтеза мРНК в МНПК в группе здоровых добровольцев при воздействии исследуемых пептидов ex vivo. Было показано, что пептиды Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс), Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанк) и Thr-Lys-Pro ex vivo влияли на экспрессию генов цитокинов, вырабатываемых Thl. Пептиды Arg-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro изменяли синтез мРНК цитокинов, синтезируемых Thl и моноцитами/макрофагами. Пептиды Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, Lys-Pro-Arg изменяли ex vivo транскрипцию цитокинов, синтезируемых Thl и Th2. При использовании пептидов Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс), Thr-Lys-Pro-Arg ex vivo были отмечены подавление или активация генов цитокинов, синтезируемых Thl, Th2 и моноцитами/макрофагами. А пептиды Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, Gly-Pro вызывали ex vivo изменение экспрессии генов цитокинов, синтезируемых в основном Th2. Пептиды Thr-Lys-Pro-Gly-Pro, Thr-Lys, Arg-Pro влияли ex vivo на синтез на уровне транскрипции цитокинов, синтезируемых Th2 и моноцитами/макрофагами.
По-видимому, можно ожидать, что пептиды, вызывающие экспрессию генов Thl-цитокинов,
564
АНДРЕЕВА и др.
будут активировать клеточный иммунитет и могут быть эффективны, в основном, при профилактике или лечении инфекций, вызываемых вирусами и другими внутриклеточными паразитами. В свою очередь можно предположить, что исследуемые пептиды, активирующие гены ТМ-цитокинов, будут стимулировать гуморальный иммунитет и, вероятно, могут быть эффективны при инфекциях, вызываемых внеклеточными возбудителями. Однако при многих заболеваниях могут нарушаться (изменяться) оба типа иммунного ответа.
При этом впервые показано, что в клетках крови здоровых добровольцев исследуемые пептиды по-разному могут влиять на синтез мРНК цито-кинов, вырабатываемых различными иммуно-компетентными клетками. При ряде заболеваний активация иммунной системы противопоказана, а избыточный синтез ряда цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ИФН-у, ИЛ-2) может являться показателем обострения процесса. Поэтому исследуемые пептиды (например, Arg-Pro-Gly-Pro и Pro-Gly-Pro), угнетающие транскрипцию ИЛ-4, ИЛ-10, ИФН-у, по-видимому, являются перспективными для использования в терапии аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз, аллергия идр.).
Эти данные позволяют предположить, что в условиях клинического применения исследуемых пептидов в дополнение к прямому повышению устойчивости клеток к инфекции при изменении спектра продуцируемых цитокинов может также происходить и активация противоинфекционно-го иммунитета. Исходя из полученных данных, показывающих способность исследованных пептидов изменять ex vivo экспрессию генов цитокинов в МНПК больных, можно провести отбор перспективных в клиническом отношении пептидов, которые, по-видимому, могут быть эффективны при инфекционных заболеваниях. Так, при хламидиозе, вероятно, могут обладать проти-воинфекционной активностью пептиды Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанк), Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly; при микоплазменн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.