НЕИРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 3, с. 240-245
КЛИНИЧЕСКАЯ НЕЙРОХИМИЯ
УДК 616.89:575.191
СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ Ма^^р-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В МОНОНУКЛЕАРАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ
С АФФЕКТИВНЫМИ РАССТРОЙСТВАМИ © 2014 г. И. С. Лосенков*, С. А. Иванова, Н. А. Вялова, Г. Г. Симуткин, Н. А. Бохан
Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт
психического здоровья СО РАМН, Томск
Сигнальный путь АкЙ/ОЗК-3р участвует в регуляции нейрональных процессов. Цель исследования — изучение внутриклеточного содержания белков АкЙ и 0$К-3р и их фосфоформ у больных с аффективными расстройствами. Обследовано 60 больных с диагнозами депрессивный эпизод, рекуррентное депрессивное расстройство и биполярными аффективными расстройствами (БАР) и 34 психически и соматически здоровых лиц. Методом иммуноблоттинга в мононуклеарах периферической крови изучено содержание белков АШ/ОЗК-ЗР-сигнального пути (общая киназа гликоген-синтазы Зр (ОЗК-ЗР), фосфо-серин-9-О$К-3р, общая протеинкиназа АШ, фосфо-серин-473-Ак!). Выявлено повышенное содержание общей ОЗК-3р у больных с аффективными расстройствами. Уровень О$К-3р был выше у пациентов с рекуррентной депрессией по сравнению с больными с депрессивным эпизодом. Содержание общей АкЙ было снижено в группах больных по сравнению с контрольной группой, снижение фософо-серин-473-АкЙ наблюдалось у пациентов с депрессивными расстройствами. Полученные результаты подтверждают гипотезу о вовлеченности киназы гли-когенсинтазы-3р в патогенез аффективных расстройств.
Ключевые слова: киназа гликогенсинтазы-3$ (08К-3$), АШ1, депрессивные расстройства, биполярные расстройства.
DOI: 10.7868/S1027813314030108
Аффективные расстройства представляют серьезную социально-экономическую и медицинскую проблему современного общества [1]. Частота встречаемости данной патологии в общей популяции составляет 5—20% [2]. Нейробиологи-ческие механизмы, лежащие в основе патогенеза аффективных расстройств, являются не до конца изученными [3]. В настоящее время большое внимание уделяется изучению процессов дизрегуля-ции внутриклеточных сигнальных путей, как одному из факторов патогенеза психических расстройств [4—7]. Считается, что протеинкиназы, задействованные в нейробиологических процессах, могут быть маркерами для диагностики и прогноза аффективных расстройств или мишенями для новых методов фармакотерапии [8, 9].
Сигнальный путь Akt1/GSK-3p участвует в регуляции большого количества клеточных функций. Внутриклеточный белок Aktl (изоформа протеинкиназы B) активируется путем фосфори-лирования по остатку серина в положении-473 и регулируется такими молекулами как серотонин, дофамин, BDNF (brain-derived neurotrophic fac-
*Адресат для корреспонденции: 634014, Томск, ул. Алеутская, д. 4; тел.: 3822-72-38-32; e-mail: innokenty86@mail.ru.
tor), NGF (nerve growth factor), GNF (glial growth factor). Активная Aktl в свою очередь ингибирует киназу гликогенсинтазы 3р (GSK-3P), путем фос-форилирования ее по серину-9 [10]. GSK-3P — важнейший белок, задействованный в нейро-нальных процессах. Изменяя активность более 50 белков-мишеней, данный фермент принимает участие в регуляции процессов метаболизма, клеточной пролиферации, апоптоза, клеточного цикла, эмбриогенеза, нейротрансмиссии, нейро-дегенерации, формирования нейрональной полярности, синаптической пластичности, цирка-дианных ритмов [11, 12]. Начало изучению роли GSK-3P в патогенезе аффективных расстройств положило открытие в 1996 г. способности нормо-тимика лития эффективно блокировать GSK-3 и ее изоформы [13]. В дальнейшем на моделях животных было показано, что нормотимический эффект лития, а также других психотропных препаратов (антидепрессанты, антиконвульсанты, антипсихотики) определяется ингибированием GSK-3p. Причем повышенная активность этого белка вовлечена в формирования как депрессивно-, так и маниакально-подобных симптомов у животных [14].
СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ Aktl/GSK-ЗР-СИГНЛЛЬНОГО ПУТИ
241
В настоящее время немногочисленное количество работ посвящено изучению состоянию ЛкИ/08К-3р-сигнального пути у пациентов с аффективными расстройствами. Часть из них выполнена на постмортальном материале, что затрудняет интерпретацию результатов, в связи с тем, что активность С8К-3Р начинает убывать в первые минуты после смерти [15]. Практически не изучена активность этих белков при депрессивных расстройствах, а также не найдена их связь с разнообразием клинических проявлений аффективных расстройств.
Цель исследования — изучение внутриклеточного содержания белков ЛкИ и С8К-3Р и их фос-фоформ у больных с аффективными расстройствами. В качестве клеточной мишени были выбраны мононуклеары периферической крови, так как они являются удобной и адекватной моделью для оценки различных молекулярных и биохимических процессов, протекающих в организме пациентов [16, 17].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Было обследовано 60 больных аффективными расстройствами, проходивших лечение в отделении аффективных состояний клиник ФГБУ "НИИПЗ" СО РАМН. Основными критериями включения являлись клинически верифицированные диагнозы депрессивного эпизода (МКБ-10: Б32), рекуррентного депрессивного расстройства (МКБ-10:Б33), биполярного аффективного расстройства (БАР) (МКБ-10:Б33), отсутствие органических или неврологических расстройств. Дополнительно для группы пациентов с БАР критерием исключения явился прием препаратов лития, так как известно, что литий способен повышать фосфорилиро-вание С8К-3Р по серину-9 [18]. В группу больных с депрессивным эпизодом вошли 26 пациентов (средний возраст 47.5 лет (37.5—58.6)) из них 6 мужчин и 20 женщин. Группа пациентов с рекуррентным депрессивным расстройством составила 18 человек (средний возраст 50.0 лет (44.0— 58.5), 3 мужчин и 16 женщин). Биполярные аффективные расстройства наблюдались у 16 человек (6 мужчин и 10 женщин, средний возраст 37.5 лет (27.2—58.0)). В группу контроля вошли 34 психически и соматически здоровых донора (средний возраст 27.5 лет (24.0—40.2)) из них 9 мужчин и 25 женщин. Исследование проводилось в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов (2000 г.).
Материалом для исследования служила венозная кровь обследуемых лиц, взятая утром натощак из локтевой вены до начала терапии, в пробирки, содержащие ЭДТА. Мононуклеары выде-
ляли из крови путем центрифугирования на градиенте плотности фиколла (р = 1.077 г/см3) ("Sigma-Aldrich", США) по стандартной методике [19]. Далее мононуклеары аликвотировали в количестве 2 х 106 и использовали для приготовления клеточных лизатов. К выделенным из периферической крови мононуклеарам в количестве 2 х 106 добавляли 4 мкл смеси протеиназных ингибиторов ("Fermentas", США), 2 мкл смеси ингибиторов серин-треониновых фосфатаз ("Sig-ma-Aldrich", США) и 200 мкл лизирующего буфера (50 ммоль Трис-HCl (рН = 6.5), 100 ммоль ди-тиотреитола, 0.1%-ный бромфеноловый синий, 10%-ный глицерол, 2%-ный натрия додецилсуль-фат). Затем тщательно перемешивали и инкубировали 15 мин при 95°С. Остывшие до комнатной температуры лизаты еще раз перемешивали и центрифугировали 10 мин при 12000 об./мин и отбирали надосадок. Полученные клеточные ли-заты в объеме 20 мкл использовались для электрофореза в SDS-полиакриламидном геле по стандартной методике [20].
Для последующего исследования белки переносили на ПВДФ (поливинилденфторид)-мем-брану (Bio-Rad, США) на приборе Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, США). Далее мембраны инкубировались с первичными (в разведении 1 : 1000) и вторичными антителами (в разведении 1 : 300) (Abcam, Великобритания) с последующей хрома-тографической детекцией по набору Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad, США). Вычисление оптической плотности полосы исследуемого белка и обработку изображения проводили с использованием системы гель-документации Alliance 2.7 (Uvitech Cambridge, Великобритания). Уровень исследуемого белка в пробе рассчитывался как отношение к референсному сигналу Р-актина (общая GSK-3 Р/Р-актин, общая AktVP-актин). Относительный уровень фосфоформ GSK-Зр и Akt1 рассчитывался по отношению к уровню их общих фракций (фосфо-серин-9 GSK-Зр/общая GSK-Зр, фосфо-серин-473 AkU/общая Akt1).
Статистическая обработка результатов проводилась при помощи программы SPSS 20.0. Проверка нормальности распределения изучаемых показателей проводилась по критерию Колмогорова—Смирнова. Для каждой выборки вычисляли медиану, 25% и 75% квартили, достоверность различий между группами определяли по критериям Манна—Уитни и Краскела—Уоллеса. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследовали содержание белков АШ и GSK-3P и их фосфорилированных форм: фосфо-серин-473-Akt1 и фосфо-серин-9 GSK-3p. В связи с тем,
242
ЛОСЕНКОВ и др.
0.61 (0.48-0.66)
0.75* (0.60-0.84)
0.78* (0.69-0.99)
0.61 (0.51-0.61)
0.55 (0.51-0.61)
0.51 (0.44-0.56)
0.85 (0.51-1.00)
0.61* (0.53-0.78)
0.59* (0.55-0.77)
§ 1.0 I 0.9
-ак 0.8 ^ 0.7 £/ 0.6 К-3 0.5
£ 0.4 ф 0.3
ая 0.2
^ 0 1
б
О0
^ 1.0 5/ 0.9
^ са 0.8
з з0.7 ^ 0.6
§ ° 0.5
& | 0.4
? I 0.3 фо об 0.2
с
ос 0.1 9 0
1.0
1 0.9
ти 0.8
к
-а 0.7 ^ 0.6
2 0.5 < 0.4
щая 0.3 ю 0.2 ° 0.1 0
^ 1.0 § 03
-А 0.8 £ ^ 0.7 0.6
I ^ 0.5
ер ща 0.4 сб о-с об 0.3
сф 0.2
о 0.1
Э 0
□ Контроль
□ Депрессивные расстройства
□ Биполярные расстройства
Рис. 1. Содержание общей О8К-3Р, фосфо-серин-9-О8К-3Р, общей АШ и фосфо-серин-473-АкЮ в группах контроля и больных. *р < 0.05.
что средний возраст в группе контроля был достоверно ниже по сравнению с группой больных с депрессивными расстройствами (р = 0.001), был произведен корреляционный анализ для установ-
0.74 (0.61-0.90)
0.61* (0.51-0.74)
0.76 (0.72-0.83)
ления связи между возрастом и содержанием исследуемых белков. По данным анализа не было выявлено значимых корреляций между исследуемыми показателями (р > 0.05). В результате исследования внутриклеточного содержания белков АкЮ и О8К-3Р, а также их фосфоформ были получены следующие результаты. Уровень общей О8К-3Р значимо о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.