ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2009, том 56, № 5, с. 718-725
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:582.475
Статья посвящается светлой памяти известного физиолога растений д.б.н. Елены Григорьевны Мининой
СОДЕРЖАНИЕ ФИТОГОРМОНОВ В МИКРОСТРОБИЛАХ И АНДРОКЛИННОМ КАЛЛУСЕ In Vitro У ЛИСТВЕННИЦЫ
СИБИРСКОЙ
© 2009 г. И. Н. Третьякова*, А. С. Иваницкая*, А. Н. Иванова**, А. В. Барсукова*
* Институт леса им. ВН. Сукачева, Сибирское отделение Российской академии наук, Красноярск ** Сибирский федеральный университет, Красноярск Поступила в редакцию 09.04.2008 г.
Феномен андроклинии у растений связан с переключением развития мужских генеративных клеток -микроспор, с обычного для них гаметофитного пути на спорофитный путь развития. Среди хвойных растений андроклинный каллус и эмбриоиды (зародышеподобные структуры микроспориального происхождения) были получены у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) в культуре in vitro. Изучение гормонального баланса андроклинных культур лиственницы с помощью метода иммуно-ферментного анализа показало, что в них значительно увеличивается содержание фитогормонов всех классов, по сравнению с исходными эксплантами (микростробилами), особенно цитокининов и АБК, что, вероятно, связано с активными клеточными делениями и образованием эмбриоидов. При этом в андроклинных культурах у непораженных лиственничной почковой галлицей (Dasineura rozhkovi Mam. et Nik) деревьев по сравнению с пораженными деревьями наблюдали увеличение содержания цитокининов (в 2 раза) и снижение содержания АБК (в 2 раза), что свидетельствует о более интенсивном росте культур непораженных деревьев. Содержание фитогормонов в андроклин-ном каллусе сравнивали с их накоплением в зародышах семян лиственницы, собранных с непораженных деревьев. Был сделан вывод о том, что для успешного роста андроклинных культур и получения эмбриоидов необходимо дополнительное внесение в среду ауксинов (не более 0.5 мг/л).
Ключевые слова: Larix sibirica - иммуноферментный анализ - зиготический зародыш - эндосперм - ан-дроклиния - морфогенный каллус - эмбриоид
ВВЕДЕНИЕ
Андроклиния in vitro - феномен перехода спо-рогенных клеток с гаметофитного пути развития, на спорофитный путь в культуре in vitro, представляет собой одно из перспективных направлений для получения гаплоидных и дигаплоидных растений-регенерантов в современных биотехнологических исследованиях. Это явление активно изучается у различных представителей покрытосеменных растений [1-6], в то время как у голосеменных растений подобные исследования редки и только начинаются [7, 8].
Лиственница сибирская (Larix sibirica Ledeb.) -один из основных лесообразователей Сибири, подвержена сильному негативному влиянию многих энтомовредителей, и в частности, листвен-
Адрес для корреспонденции: Третьякова Ираида Николаевна. 660036 Красноярск, Академгородок, 50. Институт леса СО РАН. Электронная почта: culture@ksc.krasn.ru
ничной почковой галлицы (Dasineura rozhkovi Mam. et Nik). Самки галлицы откладывают яйца в основание начинающих охвоение брахибластов (ограниченный в росте укороченный побег) [9], после чего происходит разрастание почки в крупную конусообразную чешуйчатую тератоморфу (изменение строения органа в результате действия вредителя) [10, 11]. При очень сильном заражении на деревьях почти не остается почек старше двух лет, и микро- и макростробилы (соответственно мужские и женские стробилы, видоизмененные укороченные побеги, на которых находятся специализированные листья - спорофиллы, формирующие спорангии - генеративные органы) не образуются [10].
В любых природных насаждениях лиственницы до 1-3% особей генетически устойчивы к лиственничной почковой галлице [10]. Некоторые исследователи склонны предполагать, что это связано с различием устойчивых и неустойчи-
вых к поражению галлицей деревьев по содержанию фитогормонов [12].
Размножение устойчивых к поражению энто-мовредителями деревьев имеет особо важное значение. Разработка и применение современных биотехнологий, таких как соматический эмбриогенез и андроклиния, позволит получить устойчивые к лиственничной почковой галлице чистые линии лиственницы сибирской и их массовое тиражирование.
Известно, что многие растения являются гор-монозависимыми при культивировании их in vitro, и при индукции у них андроклинии [13, 14]. Поскольку подбор оптимальной концентрации гормональных компонентов питательной среды для регенерации растений в каллусной культуре in vitro достаточно трудоемок и дорогостоящ, исследователи ищут надежный подход к прогнозированию содержания эндогенных фитогормонов на основе физиологических показателей каллусов, высаженных на питательную среду [13, 14].
К сожалению, данные о содержании гормонов в генеративных и вегетативных органах хвойных растений в литературе крайне редки [15-17]. Изучение фитогормонов и ингибиторов роста в генеративных органов хвойных в связи с их морфогенезом посвящены исследования Е.Г. Мининой [16, 18]. В проведенных ею экспериментах была показана динамика содержания ауксинов, гиббе-реллинов, цитокининов, а также ингибиторов роста в развивающихся женских шишках и пыльце представителей хвойных. Изучая физиологические аспекты появления уникальных особей сосны сибирской с однолетним циклом развития женской шишки, Минина связала появление этого феномена с увеличением концентрации фитогормонов в спорофитных тканях. Это отразилось на состоянии гаметофита - происходила акселерация его развития, сверхраннее формирование яйцеклетки и семян. Исследования гормонального баланса у хвойных в культуре in vitro практически отсутствуют. Между тем, проведение сравнительных исследований содержания гормонов в зрелых зиготических семенах, микростробилах и андроклинном каллусе данного класса растений позволит отрегулировать гормональный баланс для успешного выращивания андроклинных каллусов, их пролиферации и получения эмбриоидов.
Цель настоящего исследования - изучить гормональный баланс в микростробилах и андро-клинном каллусе лиственницы сибирской и сравнить полученные данные о содержании гормонов в указанных структурах и зиготических семенах.
МЕТОДИКА
В работе использовали семена, микростробилы и андроклинный каллус лиственницы сибир-
ской (Larix sibirica Ledeb.). Сбор зрелых семян и микростробилов осуществляли с деревьев 30-35-летнего возраста, произрастающих в Дендрарии Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН. В исследованиях использовали деревья, устойчивые к поражению лиственничной почковой галлицей (Dasineura rozhkovi Mam. et Nik) и неустойчивые к данному энтомовредителю.
В конце марта-начале апреля микростробилы лиственницы сибирской, содержащие микроспо-роциты на стадии мейоза (профаза I), очищали от покровных чешуй. Для получения андроклинных культур микростробилы на стадии мейоза подвергали стрессовой обработке низкими положительными температурами (2-3°С) в течение 1-3 суток в условиях хладотермостата. После этого эксплан-ты помещали на питательную МС-среду [19], содержавшую 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 или 10 мг/л 2,4-Д. В качестве желирующего компонента использовали агар в концентрации 6 г/л. pH среды до авто-клавирования доводили до 5.6 ± 0.1. Через два месяца культивирования использовали образцы, содержавшие многоклеточные зародышеподобные структуры - эмбриоиды. Микростробилы, андро-клинные каллусы, зародыши и эндосперм семян фиксировали жидким азотом, лиофильно высушивали и анализировали.
Семена лиственницы сибирской собирали в конце августа, из них извлекали эндосперм и зародыши. Иммуноферментный анализ растительных образцов проводили в лаборатории физиологии растений Института биологии УНЦ РАН по методике, разработанной проф. Г.Р. Кудояровой с соавт. [20, 21]. Было определено содержание ИУК, АБК и цитокининов.
Эксперименты были проведены в двух биологических повторностях (по 25 образцов от 20 деревьев), в таблицах представлены средние арифметические и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Стадия развития микростробилов и получение андроклинных культур
В естественных условиях произрастания мик-роспорогенез у лиственницы начинается осенью (октябрь). Микроспороциты зимуют на стадии профазы I и весной (март-апрель) завершают редукционные деления. В весенний период микроспорофиллы лиственницы отличаются высокой цитофизиологической активностью - в них идут интенсивные редукционные деления.
У взятых для микроклонирования микростробилов лиственницы в мейотической стадии развития в течение всего осенне-зимнего и ранневесен-него периода происходило быстрое завершение мейоза в культуре in vitro (в течение нескольких
Рис. 1. Макро- и микростробилы (м) лиственницы сибирской на стадии формирования мужского гаметофита. Масштабная линейка равна 3 мм.
дней) и наблюдали переключение развития мик-роспороцитов с гаметофитного на спорофитный путь. Наиболее перспективными для культивирования оказались микроспороциты на стадии мей-оза ранней весной (рис. 1).
В период микроспорогенеза (конец марта-начало апреля) микростробилы помещали на среду МС с 0.2-0.5 мг/л 2,4-Д, через 1-2 суток культивирования наблюдали распад тетрад и происходило образование микроспор. В течение 7-10 суток. культивирования проходил митоз, и микроспоры делились на две равные клетки, т.е. становились на аномальный (спорофитный) путь развития. В течение 14-21 суток формировался андроклин-ный каллус, в котором шли активные клеточные
Таблица 1. Содержание фитогормонов в микроспорофиллах и андроклинном каллусе лиственницы сибирской
Объект
Содержание фитогормонов, нг/г сухого веса
цитокинины ИУК АБК
Микро- пораженные 288 ± 39 21 ± 3 92 ± 12
стробилы деревья
непоражен- 284 ± 57 15 ± 4 50 ± 7
ные деревья
Андро- пораженные 629 ± 84 107 ± 21 428 ± 47
клинный деревья
каллус
непоражен- 1324± 150 72 ± 10 282 ± 20
ные деревья
деления - происходило формирование эмбриои-дов (рис. 2). При увеличении содержания 2,4-Д до 2-5 мг/л образование андроклинного каллуса у лиственницы не происходило. На 14-е сутки культивирования микростробилы подвергались некрозу и погибали.
Содержание эндогенных фитогормонов в микростробилах, андро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.