РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 3-4, с. 360-366
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИМЫХ РЕЦЕПТОРОВ И АУТОАНТИТЕЛ К Т^-а У ЗДОРОВЫХ ИНДИВИДОВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИ-Т^-а АУТОАНТИТЕЛ
© 2011 г. Ю.А. Лопатникова, Ф.Д. Киреев, Е.А. Голикова, А.И. Аутеншлюс*, А.В. Соснина*, С.В. Сенников
НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск, Россия;
*НИИмолекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск, Россия
Поступила: 07.07.2011. Принята: 07.10.2011
Аутоантитела к цитокинам могут выполнять ряд существенных биологических функций, таких как нейтрализация цитокинов, регуляция их биологической активности и увеличение длительности их существования в системной циркуляции путем образования иммунных комплексов. ТЫБ-а — это иммуномодулирующий цитокин с широким спектром биологических эффектов и сложной системой функционирования. Эта система включает два типа мембраносвязанных и два типа растворимых рецепторов, а также аутоантитела к ТЫБ-а. Целью данной работы являлось изучение содержания в сыворотке условно-здоровых доноров медиаторов, регулирующих активность ТЫБ-а: растворимых рецепторов I и II типов и аутоантител к цитокину, а также исследование биологической активности естественных аутоантител к ТЫБ-а. Методами иммуноферментного анализа в сыворотке крови здоровых доноров было определено содержание свободной формы ТЫБ-а 5,94 нг/мл, рецептора I типа к ТЫБ-а 1,29 нг/мл, рецептора II типа к ТЫБ-а 0,77 нг/мл. При оценке содержания подклассов !дС аутоантител к ТЫБ-а получены следующие данные: !дС1 — 4,78 нг/мл, !дС2 — 3,14 нг/мл, !дС3 — 0,52 нг/мл и !дС4 — 0,308 нг/мл. При изучении биологической активности аутоантител было показано специфическое действие комплекса ТЫБ-а/аутоантитела к ТЫБ-а в тестах по отмене цитотоксического действия ТЫБ-а на клеточную линию Ь929, а также по стимуляции продукции иммунорегуляторных цитокинов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови. Полученные данные свидетельствуют, что аутоантитела к ТЫБ-а принимают участие в функционировании иммунной системы организма и могут оказывать костимули-рующие эффекты, увеличивая активность ТЫБ-а.
Ключевые слова: фактор некроза опухоли альфа, аутоантитела, растворимые рецепторы
ВВЕДЕНИЕ
Фактор некроза опухоли альфа (TNF-a) — это многофункциональный цитокин, продуцирующийся такими клетками, как моноциты, макрофаги, Т- и В-лимфоциты, эози-нофилы, базофилы, тучные клетки, NK-клет-ки, купферовские клетки, клетки гладкой мышечной ткани, кератиноциты и фибро-бласты. TNF-a активирует иммунный ответ против опухолевых клеток in vivo, вызывает цитолиз многих опухолевых клеточных линий in vitro. TNF-a активирует макрофаги, увеличивая экспрессию молекул МНС на их
Адрес: 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14, НИИ клинической иммунологии СО РАМН. E-mail: sennikov_sv@mail.ru
поверхности и синтез молекул адгезии, ней-трофилы, вызывая продукцию ими супероксидных радикалов и лейкотриенов, увеличивает проницаемость эндотелия, индуцирует продукцию таких цитокинов как IL-1, IL-6, IL-10, TGF-p, индуцирует апоптоз, ингибирует передачу сигнала с Т-клеточных рецепторов и костимуляторных сигналов дендритным клеткам, подавляет пролиферацию лимфоцитов. Физиологическая роль TNF-a in vivo характеризуется широким спектром активностей, общеизвестно, что TNF-a необходим в защите организма против бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных инфекций и других различных стрессовых стимулов [1].
Известно два типа мембраносвязанных рецепторов к TNF-a, относящихся к суперсемей-
ству TNF-рецепторов: рецептор I типа (TNFPI, CD120a) белок с молекулярной массой 55 — 60 kDa и рецептор II типа (TNFPII, CD120b) с молекулярной массой 75 — 80 kDa. Характерной особенностью TNFPI является наличие на его С-конце так называемого «домена гибели», вовлеченного в TNF-опосредованный апоптоз, в то время как TNFPII лишен такого домена [2]. Кроме того, существуют и растворимые формы рецепторов к TNF-a ^TNFPI и рТNFРII). Они являются продуктами протео-лиза мембраносвязанных рецепторов TNF-a
I и II типов металлопротеиназой, называемой TNF-a-конвертирующий фермент. Кроме того, известно, что растворимый рецептор
II типа может образовываться путем альтернативного сплайсинга [3]. С одной стороны, эти рецепторы могут нейтрализовать TNF-a в системной циркуляции и ингибировать его биологическую активность, с другой стороны, комплексы TNF-a/растворимый рецептор можно рассматривать в качестве пула, из которого TNF-a постепенно высвобождается [4].
В последние годы получены данные о наличии аутоантител (ААТ) ко многим цитокинам, они представлены в высоких концентрациях в системной циркуляции у пациентов с различными инфекционными и аутоиммунными заболеваниями, но также обнаруживаются и в сыворотках здоровых доноров [5, 6]. Анти-цитокиновые аутоантитела поддерживают го-меостаз, стабилизируя воспалительные процессы и предотвращая повреждение тканей, в то же время некоторые антитела могут увеличивать время полужизни цитокина in vivo, действуя как белок-носитель [6]. Было показано наличие аутоантител к TNF-a у больных различными воспалительными заболеваниями, в том числе ревматоидным артритом, где они ингибируют цитотоксические эффекты самого цитокина [7]. Однако существуют данные о том, что комплексы TNF-a и антител к нему способны усиливать эффекты данного медиатора [8, 9].
Tаким образом, система функционирования важного иммунорегуляторного цитокина TNF-a достаточно сложна и включает в себя два типа растворимых рецепторов к TNF-a, два типа мембраносвязанных рецепторов и аутоантитела к TNF-a. Цель данной работы — изучение содержания в сыворотке условно-здоровых доноров медиаторов, регулирующих активность TNF-a: растворимых рецепторов I и II типов и аутоантител к цитокину, а также исследование биологической активности естественных аутоантител к TNF-a.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение антител класса IgG из крови человека
В работе использовалась периферическая кровь 14 условно здоровых доноров, включенных в группу по результатам опроса и результатам латекс-теста на С-реактивный белок (ООО «Ольвекс диагностикум»), в соответствии с методикой производителя. Результат считали отрицательным при концентрации СРБ в сыворотке крови < 6 мкг/мл. Сыворотку получали центрифугированием цельной крови в течение 15 мин (3000 об/мин). Перенос сыворотки в соответствующий буфер, необходимый для дальнейших процедур аффинной очистки антител, осуществлялся с помощью колонки с Вю-Се1 Р 6 DG (Bio-Rad, США). Фракции, содержащие высокомолекулярные компоненты сыворотки, объединяли и наносили на колонку с Protein G Sepharose (GE Healthcare, США).
Колонку с Protein G Sерharose 4 Fast Flow аффинным сорбентом (объем колонки 3 мл) уравновешивали 0,1 М Ыа-ацетатным буфером (рН 5,0). Высокомолекулярные фракции с Bio Gеl Р 6 DG наносили на Protein G Sерharose, а затем промывали колонку до исчезновения оптической плотности. Неспецифически связавшиеся компоненты удаляли с колонки тремя объемами 0,1 М Ыа-ацетатного буфера, содержащего тритон X 100 (0,5%) и ЫаС1 (0,5 М). Затем колонку промывали 0,1 М Ыа-ацетатным буфером до полного исчезновения оптической плотности. Элюцию антител осуществляли 0,1 М Gly-HQ буфером (рН 2,7) в 1,5 мл пробирки, содержащие 50—150 мкл 1 М Tris-HQ буфера (рН 9,0), при необходимости собранные фракции тут же дополнительно нейтрализовали до физиологических значений рН. Фракции антител объединяли и диализовали против не менее чем 100-кратного по объему 50 тМ Tris-НС! буфера (рН 7,5), содержащего 150 тМ ЫаС1 (ОЫ, +4 °С). От-диализованные фракции антител наносились на колонку с TNF Sерharose с аффинным сорбентом.
Аффинная хроматография IgG на ТNF Sерhaюse
На предварительно уравновешенную 50 тМ Tris-НС! буфером (рН 7,5), содержащим 150 тМ Nad, колонку, наносили отдиа-
лизованные фракции антител после Protein G Sepharose. Колонку затем промывали 50 тМ Tris-На буфером (рН 7,5) с 150 тМ Nad до исчезновения оптической плотности. Неспецифически связанные компоненты отмывали двумя объемами 50 тМ Tris-НС! буфером (рН 7,5), содержащего 0,5 М Nad. Затем колонку промывали 50 тМ Tris-НС! буфером (рН 7,5) с 150 тМ №С! до исчезновения оптической плотности. Элюцию антител осуществляли 0,1 М Gty-НС! буфером (рН 2,7) в 1,5 мл пробирки, содержащие 50- 150 мкл 1 М Tris-НС! буфера (рН 9,0), при необходимости собранные фракции тут же дополнительно нейтрализовали до физиологических значений рН. Фракции объединяли и диа-лизовали против не менее чем 100-кратного по объему 20 тМ №-фосфатного буфера (рН 7,3-7,4), содержащего 150 тМ №С! (ON, + 4 °С). Отдиализованные антитела концентрировали в диализных мешках при +4 °С до 100-200 мкл и еще раз диализовали против 20 тМ ^-фосфатного буфера (рН 7,3-7,4), содержащего 150 тМ Nаd, аликвотировали и хранили на +4 °С и -20 °С для дальнейшего использования.
Определение компонентов системы ТNF-a
Сывороточное содержание медиаторов и определение иммунорегуляторных цито-кинов в кондиционных средах проводили методом твердофазного ИФА, согласно инструкции производителей. Уровень общего уровня TNF-a определяли с использованием набора альфа-TNF - ИФА - БЕСТ (Вектор-Бест, Россия). Уровень растворимых рецепторов TNF-a I и II типов определяли с помощью наборов Нитап soluble TNFR1 ELISA Kit и Нитап soluble TNFR2 ELISA Kit (Се!! Science, США). Содержание антител субклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 определяли с использованием набора Подклассы IgG -ИФА - БЕСТ (Вектор-Бест, Россия). Уровень IFN-y, IL-1 ß, IL-6, IL-4 оценивали с помощью соответствующих наборов фирмы Вектор-Бест (Россия). Для определения абсолютного содержания аутоантител класса IgG использовался сборный набор: рекомбинантный человеческий TNF-a (ООО «Центр инженерной иммунологии»), антитела к субклассам, меченные пероксидазой хрена (Полигност), реактивы TМБ и СТОП реагент (ЗАО НВО «Иммунотех»).
Определение биологической активности ААТк mF-a
МНК получали из периферической крови условно-здоровых доноров, на градиенте плотности фиколл-урографина стандартным методом. Культивирование проводили в среде RPMI-1640, содер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.