ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ ^
УДК 582.475.2:581.3:58.085
СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ in vitro ТРЕХ ВИДОВ ЛИСТВЕННИЦЫ
© 2012 г. И. Н. Третьякова, А. В. Барсукова
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, 660036 Красноярск, Академгородок, стр. 50
E-mail: culture@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 21.04.11 г. Окончательный вариант получен 30.01.12 г.
Формирование эмбриогенного каллуса у видов лиственницы, произрастающих в Сибири (Larix si-birica, L. gmelinii, L. sukaczewii) происходило на среде MSGm под действием регуляторов роста (2.4Д и БАП) по одной схеме: вытягивание соматических клеток, их асинхронное деление с образованием инициали эмбрио и клетки трубки. Клетки инициали претерпевали последовательные деления и формировали эмбриональные глобулы, ведущие к формированию соматических зародышей. При добавлении в среду АБК и ПЭГ происходило вызревание соматических зародышей и затем последующее их прорастание. У лиственницы Сукачева и ее гибрида с лиственницей сибирской получены длительно пролиферирующие эмбриогенные клеточные линии и растения регенеранты. Успех соматического эмбриогенеза зависел от генотипа дерева донора.
Ключевые слова: соматический эмбриогенез, культура in vitro, лиственница сибирская, лиственница Гмелина, лиственница Сукачева.
Важной жизненной стратегией растительных организмов является тотипотентность их клеток. Реализация этой стратегии ярко проявляется в культуре in vitro и особенно через соматический эмбриогенез.
Соматический эмбриогенез — асексуальный способ размножения у голосеменных растений — был открыт 26 лет назад у Picea abies (Chalupa, 1985; Hakman et al., 1985). В настоящее время с помощью соматического эмбриогенеза осуществляется изучение морфогенетических программ, таких как детерминация, дифференциров-ка, дедифференцировка и компетентность, а также проводится массовое тиражирование высокопродуктивных, устойчивых к фитопатагенам генетически улучшенных форм хвойных растений (Lelu et al., 1994; Lelu-Walter et al., 2008; Park, 2002, 2006; Klimaszewska et al., 2001).
Среди хвойных, представители рода Larix являются наиболее распространенными лесообра-зующими древесными видами на территории России. Они различаются по морфологическим признакам, лесоводственным характеристикам, ритмам сезонного развития и морфогенеза вегетативных и генеративных органов, а так же характеризуются быстрым ростом, энергичной ассимиляцией, транспирацией и высокой продуктив-
Сокращения: 2.4-Д — дихлорфеноуксусная кислота, БАП — 6-бензил аминопурин, АБК — абсцизовая кислота, ПЭГ — полиэтиленгликоль, ИМК — инолилмасляная кислота, Ое!гйе — желирующий агент, ЭМ — эмбриональная масса.
ностью (Дылис, 1947; Рожков и др., 1991; Ирошников, 2004).
Занимая обширный ареал, виды рода Ьапх обладают чрезвычайно высокой пластичностью, отличающей ее от других представителей семейства Ртаевав (Третьякова и др., 2006). Этот признак связан с периодическим сбрасыванием хвои, переключением брахибластов на генеративный путь развития и, наоборот, генеративных структур на спорофитный путь развития, наличием толстой оболочки, окружающей пыльцевое зерно, не позволяющей пыльце прорастать при неблагоприятных условиях, отсутствием органического покоя у генеративных и вегетативных органов в зимний период, и, в целом, большим морфогенетическим потенциалом, позволяющим видам лиственницы адаптироваться к неблагоприятным экологическим факторам (Третьякова и др., 2006).
Вместе с тем, виды лиственницы характеризуются неравномерностью урожаев в многолетнем цикле и низким качеством семян. Наиболее сильно этот феномен проявляется у лиственницы сибирской, у которой урожаи семян значительно ниже (а в отдельные годы вообще отсутствуют) по сравнению с другими представителями рода Ьапх (Тренин, 1986; Милютин, 2003; Ирошников, 2004). Кроме того, деревья лиственницы сибирской очень сильно поражаются лиственничной почковой галлицей, оказывающей сильное негативное влияние на урожай лиственничных лесов.
Для решения проблемы лесовосстановления видов лиственниц за рубежом разрабатываются программы с использованием современных биотехнологий микроклонального размножения, таких как соматический эмбриогенез (Park, 2002, 2006).
Для рода Larix соматический эмбриогенез был получен у L. decidua (von Aderkas et al., 1990), L. kaempherri (Lelu-Walter, Pagues, 2009) и гибридов L. x occidentalis (Thompson, von Aderkas, 1992), L. x eurolepis (L. decidua x L. kaempherri) (Kli-maszwska, 1989; von Aderkas et al., 1990; Lelu,1994), L. x marscinlinsii (L. kaempherri x L. decidua) (Lelu etal., 1994; Lelu-Walter, Pagues, 2009). Первая работа по инициации соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской была опубликована нами в 2008 году (Белоруссова, Третьякова, 2008). В ней впервые было показано становление соматических клеток зародыша под влиянием гормонов на путь эмбриогенеза при инициации и пролиферации морфогенного каллуса.
Однако, несмотря на активные исследования по соматическому эмбриогенезу у лиственницы сибирской, регенерация растений путем соматического эмбриогенеза все еще остается не решенной для данного вида. Критическим моментом явился процесс вызревания соматических зародышей, на котором эмбриональное развитие у лиственницы сибирской останавливалось.
Цель настоящей работы заключалась в разработке биотехнологии соматического эмбриогенеза у видов лиственницы, произрастающих на территории Сибири, с подбором минеральных сред, концентраций гормонов и желирующих агентов на процессы образования и вызревания соматических зародышей и получения растений регене-рантов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектом исследований служили 25 деревьев лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), 10 деревьев лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) и 4 дерева лиственницы Сукачева (Larix sukaczewii Dylis), произрастающих на территории дендрария Института леса СО РАН (г. Красноярск). Возраст деревьев 35—40 лет. На дереве (генотип Снп1) лиственницы Сукачева про-водилилось контролируемое опыление макростробилов пыльцой лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина.
В качестве материала для индукции соматического эмбриогенеза были взяты изолированные зиготические зародыши на стадии глобулярного зародыша, инициации и развития семядолей. Сбор посадочного материала осуществляли с июля по август в 2007—2010 гг. Семена очищали от покровных чешуй, поверхностно стерилизовали
5% спиртовым раствором йода в течение 3 минут. После 3-кратной промывки в стерильной дистиллированной воде, мегагаметофиты обрабатывали перекисью водорода в течение 5—10 минут. Зародыши извлекали из мегагаметофитов в стерильных условиях, помещали на увлажненную фильтровальную бумагу в чашках Петри и затем переносили на питательную среду.
Индукция каллуса. Для индукции каллуса у видов лиственницы использовали минеральные основы базовых сред: 1/2 MS (Murashige, Skoog, 1962), MSG (Becwar et al., 1990) и модифизиро-ванную нами среду MSGm с увеличенным содержанием некоторых микроэлементов по сравнению с исходной прописью MSG и изменным составом макроэлементов (из среды исключен KCl) (табл. 1). В качестве регуляторов роста использовали 2.4-Д (2 мг/л) и БАП (1 мг/л). В среду добавляли агар — 7 г/л; рН среды приводили к 5.8 до ав-токлавирования, которое проводили при 121°С в течение 20 мин. В охлажденную питательную среду после автоклавирования добавляли L-глута-мин. В каждой чашке Петри культивировали 5 зародышей на 20 мл индукционной среды в темноте при 25°С ± 1°С.
Пролиферация эмбриональной массы. Для пролиферации каллуса и образования эмбриональной массы (ЭМ) применяли указанные базовые среды, содержащие 2.4-Д (2 мг/л), БАП (0.5 мг/л) и сахарозу (20 г/л). Режим культивирования такой же как при индукции каллуса. Пересадки на свежую питательную среду проводили каждые 2 нед. За 7 дней до перевода каллусов на безгормональную среду (предвызревание соматических зародышей) их помещали в жидкую питательную среду MSGm (без агара) и подвергали встряхиванию на круговой качалке.
Предсозревание соматических зародышей. Кусочки активно растущей эмбриональной массы, весом 100—300 мг переносили на безгормональную базовую (MSGm) среду с активированным углем (10 г/л) и повышенным содержанием сахарозы (34 г/л), для остановки пролиферации и перехода соматических зародышей к вызреванию. Эксплан-ты культивировали в течение одной недели на свету малой интенсивности (10 мкмоль м-2 с-1) при 16-часовом фотопериоде.
Созревание соматических зародышей Эксперименты по созреванию соматических зародышей трех видов лиственницы выполняли на базовой среде MSGm, содержащей сахарозу (40-60 г/л), АБК (16-32 мг/л), ИМК (0.2 мг/л) и ПЭГ (510%) в различных вариациях (табл. 2). В качестве желирующего агента использовали Gelrite (34 г/л). Культивирование осуществляли на свету малой интенсивности (20 мкмоль м-2 с-1) при 16-часовом фотопериоде, при 24°С ± 1°С. Регуляторы роста растений (АБК и ИМК) и L-глутамин
Таблица 1. Состав базовых питательных сред MS, MSG, MSGm, используемых в экспериментах по культуре in vitro у лиственниц
Компоненты среды Концентрация компонентов в среде, мг/л
Макроэлементы: MS MSGm MSG
100 440 370 170 745
NH4NO3 KNO3
CaCl2 • 2H2O MgSO4 • H2O KH2PO4 KCl
1650 1900 440 370 170
100 440 370 170
Микроэлементы:
KI 0.83 0.83 0.83
H3BO3 0.62 3.15 0.62
MnSO4 • H2O 22.3 22.3 22.3
ZnSO4 • 7H2O 8.6 8.6 8.6
Na2MoO4 • 2H2O 0.25 0.375 0.25
CuSO4 • 6H2O 0.025 0.125 0.025
CoCl2 • 6H2O 0.025 0.050 0.025
Железо:
FeSO4 • 7H2O 27.8 27.8 27.8
Na2 • ЭДТА 37.3 37.3 37.3
Витамины и органические вещества:
Мезоинозит 100 500 100
Тиамин 0.1 0.1 0.1
Глицин 2.0 - -
Пиридоксин 0.5 0.5 0.5
Никотиновая кислота 0.5 0.5 0.5
Глутамин 500 500 500
Гидролизат казеин 1000 1000 1000
рН 5.8 5.8 5.8
стерилизовали фильтрованием и добавляли в охлажденную питательную среду после автокла-вирования.
Прорастание соматических зародышей. Для прорастания соматических зародышей лиственницы использовали базовую питательную среду М8Сш свободную от растительных регуляторов роста, дополненную активированным углем (1 г/л). Соматические
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.