УДК 576.353.2;576.08
СООТНОШЕНИЕ СТАДИЙ МИТОТИЧЕСКОГО ЦИКЛА В ПОПУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ПЛАНАРИЙ агаг^а tigrina
© 2012 г. Н. Д. Крещенко
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3;
электронная почта: nkreshch@rambler.ru Поступила в редакцию 14.07.2011 г.
В суспензии клеток, полученных из тканей предглоточной, окологлоточной и хвостовой областей тела интактных планарий ОтШа tigrina (Р1а1уЬе1ттШе8, ТигЪе11апа), подсчитывали число митоти-ческих клеток и вычисляли митотический индекс, а также процент клеток, находящихся в разных стадиях митоза. При инкубации планарий в течение 24 ч в колхицине наблюдали как общее увеличение числа митозов (в 2—2.5 раза), так и увеличение числа метафаз (в среднем в 3.5 раза) за счет изменения соотношения разных фаз митоза. Инкубация интактных (не регенерирующих) планарий в растворе нейропептида МРБ одновременно с колхицином, не влияла существенно на распределение клеток в разных стадиях митотического цикла.
Ключевые слова: стволовые клетки, пролиферация, планарии, необласты.
Планарии (тип Р1а1уЬе1т1п1Ие8, класс ТигЪе1-1айа) являются представителями беспозвоночных животных, которые характеризуются высоким регенерационным потенциалом. Они обладают особым типом тотипотентных стволовых клеток — необластов, которые служат источником для восстановления утраченных частей тела, тканей и органов после повреждения или экспериментальной ампутации, а также составляют основу ежедневного клеточного самообновления организма [1]. Согласно опубликованным данным, популяция необластов у разных видов планарий составляет 10—30% от общего числа клеток тела [2—4]. У планарий, размножающихся как половым, так и бесполым путем, линия стволовых клеток способна дифференцироваться и в половые, и в соматические клетки и поддерживаться в течение всей жизни [5, 6]. В ходе регенерации стволовые клетки делятся и образуют на раневой поверхности скопление, называемое регенерационной бластемой, где они дифференцируются в специализированные клетки (нервные, мышечные, кишечные, паренхимные и др.) [1, 7, 8]. После отсечения головного конца тела у планарий наблюдали два пика пролиферативной активности: в первые часы (через 4—12 ч) и на 2—4 сут регенерации [9—11]. Таким образом, пролиферативная активность стволовых клеток служит важным показателем морфогенетического процесса.
Процесс пролиферации и дифференцировки необластов у планарий может активироваться или подавляться под действием некоторых гормонов
и нейротрансмиттеров [12—15]. У плоских червей, к которым относятся и планарии, идентифицированы природные NPF (neuropeptide Б)-подобные пептиды [16—18], состоящие в близком филогенетическом родстве с представителями субсемейства NPY/PP-пептидов позвоночных [18, 19]. Иммуноцитохимические исследования продемонстрировали присутствие нейропептида NPF в нервной системе более чем 30 видов паразитических и свободноживущих плоских червей [17, 20—22], однако физиологическая функция этого пептида оставалась мало изученной [23, 24].
Нами получены экспериментальные данные, свидетельствующие о стимулирующем влиянии NPF на рост регенерационной бластемы, диффе-ренцировку нервных элементов и регенерацию глотки у планарий G. tigrina. Выдвинута гипотеза о морфогенетической функции NPF [8, 22, 25]. Недавно была установлена важная роль одного из NPF/NPY-подобных пептидов (NPY-8) в процессах формирования репродуктивных органов и дифференцировки половых клеток у планарий Schmidtea mediterranea [26].
В настоящей работе изучена пролиферативная активность стволовых клеток в трех областях тела у интактных (не регенерирующих) планарий G. tigrina, а также изменение числа митозов и соотношения числа клеток на разных стадиях митотиче-ского цикла у планарий, находящихся под воздействием колхицина и нейропептида NPF.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали планарий G. tigrina бесполой лабораторной расы. Животных содержали в затемненных аквариумах с водопроводной и дистиллированной водой (2 : 1) при температуре 20 ± 1°С и кормили мотылем 1—2 раза в неделю. Перед опытом планарий держали голодными в течение 1 недели. В опыт отбирали особей длиной 9—10 мм. Животных инкубировали в 0.05% растворе колхицина (Sigma), который добавляли в воду, в которой содержались планарии. Каждой подопытной группе животных соответствовала своя контрольная группа особей, содержавшихся в воде. У подопытных животных подсчитывали число митозов в суспензии клеток, приготовленных из тканей, взятых от 10 особей, учитывали также фазы мито-тического цикла (стадии поздней профазы, мета-фазы, анафазы и телофазы). Суспензию клеток готовили из фрагментов ткани длиной около 1.5 мм, которые отсекали острым глазным скальпелем в предглоточной, окологлоточной и хвостовой области тела планарий (рис. 1). Для обездвижения животных помещали на лед. Образцы ткани помещали в пробирку (Ependorff, 1.5 мл) и диссоциировали на клетки в 120—150 мкл смеси, содержащей метанол, уксусную кислоту, глицерин и фосфатный буфер в соотношении 2 : 1 : 1 : 12 в течение 30—40 мин при комнатной температуре. В конце процедуры пробирки с образцами аккуратно встряхивали до получения гомогенной суспензии. Клетки окрашивали флуоресцентным красителем, специфически связывающимся с ДНК (Hoechst-33342, Sigma), добавляя 10—12 мкл красителя (0.1 мкМ раствора в ДМСО) в пробирку с суспензией клеток, а затем фиксировали формалином в конечной концентрации 4%. Каплю клеточной суспензии помещали на предметное стекло, высушивали на воздухе, добавляли 10% раствор глицерина на фосфатном буфере (PBS, pH 7.3) и накрывали покровным стеклом. Препараты изучали под флуоресцентным микроскопом Leica DM 6000B, оснащенным цифровой фотокамерой DC 300F. На каждом стекле подсчитывали число митозов на 1000 клеток. Из одной пробы готовили три—четыре препарата, просматривая не менее 3000—4000 клеток на одну временную точку. Митотический индекс (МИ) определяли как процент митозов на 100 клеток суспензии, учитывали также число клеток, находящихся в разных стадиях митоза, и определяли их процент от общего числа митозов. Результаты обрабатывали с использованием статистической программы Prizm. Вычисляли среднее значение анализируемого показателя и стандартную ошибку (SE). Для статистического анализа применяли t-критерий Стьюдента.
В специальной серии опытов исследовали влияние нейропептида NPF на интактных (не реге-
Рис. 1. Планария 01гагМа Н^та, фото, масштаб 2 мм. Г — голова, Гл — глотка, ПГ — предглоточная, ОГ — окологлоточная и ХВ — хвостовая области тела.
нерирующих) планарий. Нейропептид МРЕ выделенный из Мотв11а вхрата [16], имеет следующую аминокислотную последовательность: PDKD-FГVNPSDLVLDNKAALRDYLRQГNEYFAГЮRPRF-МН2 (Гтшипо§епеИс8, США). В среду, в которой содержали планарий, добавляли одновременно 0.05% раствор колхицина и раствор нейропептида NPF в концентрации 0.1 или 1 мкМ. Пептид растворяли в деионизированной воде до концентрации 0.1 мМ и хранили при —20°С. Контрольная группа особей находилась в растворе колхицина. Соотношение числа клеток в разных фазах мито-тического цикла в оценивали в трех областях тела подопытных и контрольных животных после инкубации в течение 24 ч.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Морфологические характеристики необластов и стадий митоза. Число митозов и их распределение по фазам митоза определяли в тканях, взятых из трех областей тела интактных планарий — предглоточной, окологлоточной и хвостовой. Морфологически необласты представляют собой клетки небольшого размера округлой или овальной формы, имеющие большое ядро с хорошо выраженным ядрышком и тонкий слой интенсивно базофильной цитоплазмы со сравнительно слабо развитыми цитоплазматическими органеллами (см. также [15]). Такая характеристика, по-нашему мнению, соответствует фазе покоя (или G1) клеточного цикла необластов. Применяемый нами метод окраски ядер клеток не позволяет отличить покоящиеся необласты от других мелких ма-
Рис. 2. Суспензия клеток из тканей планарий (а—г). Флуоресцентная микроскопия, окраска с помощью Hoechst 33342. Видны окрашенные ядра клеток. Обозначения: П — профаза, М — метафаза, А — ранняя анафаза, Т — телофаза, И — интерфазное ядро. Масштаб 13 мкм.
^ Щк
щ
П
* & 4р
лодифференцированных соматических клеток планарий, однако позволяет выявить среди них ядра делящихся клеток, а также обнаружить и описать количественно все стадии митотического цикла.
В приготовленной нами суспензии ядра клеток, находящихся на всех стадиях митоза (профазы, метафазы, анафазы и телофазы), были неповрежденными, хорошо окрашенными и легко различимыми (рис. 2а—г). Средний размер ядер клеток, находящихся в интерфазе, составляет 9— 10 мкм в диаметре, иногда до 13 мкм. По нашим наблюдениям, пролиферирующие необласты, начиная со стадии профазы, имеют более крупные размеры ядер (примерно в 1.5—1.8 раза), чем
остальные клетки в изучаемой суспензии, а также выделяются более интенсивной их окраской. Крупные размеры ядер митотических клеток — округлых, диаметром 12—15 мкм, или овальных (13 х 17 мкм), сохраняются вплоть до стадии тело-фазы. Когда в ходе цитокенеза образуются две мелкие клетки с округлыми ядрами, их размер составляет около 7—8 мкм.
Ниже приведены морфологические характеристики, по которым клетки были отнесены к той или иной стадии митотического цикла при окрашивании суспензии клеток из тканей планарий прижизненным ДНК-связывающим флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (рис. 2а—г).
Таблица 1. Распределение клеток по фазам митотического цикла в трех областях тела планарий* под воздействием колхицина (в процентах, среднее ± SE, п — число подсчетов митозов на 1000 клеток суспензии)
Время инкубации с колхицином, ч Профаза Метафаза Анафаза Телофаза
ПГ 0 (п = 3) 47.1 ± 4.2 26.5 ± 8.5 16.9 ± 8.7 9.5 ± 4.8
ОГ 0 (п = 3) 56.7 ± 6.7 22.8 ± 6.8 3.3 ± 3.3 17.2 ± 4.3
ХВ 0 (п = 3) 51.8 ± 5.7 29.5 ± 8.9 4.2 ± 4.2 14.5 ± 1.2
ПГ 8 (п = 4) 34.8 ± 6.2 27.5 ± 14.1 13.6 ± 2.3 24.18 ± 9.2
ОГ 8 (п = 4) 34.9 ± 6.3 30.1 ± 3.1 4.2 ± 4.2 31.1 ± 5.4
ХВ 8 (п = 4) 17.9 ± 8.9 33.1 ± 4.5 12.5 ± 12.5 38.5 ± 19.9
ПГ 12 (п = 4) 4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.