научная статья по теме СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕАБСОРБЦИИ ОСМОТИЧЕСКИ СВОБОДНОЙ ВОДЫ В ПОЧКЕ И ЭНЕРГИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНАЛОГОВ ВАЗОТОЦИНА С V2-РЕЦЕПТОРОМ Биология

Текст научной статьи на тему «СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕАБСОРБЦИИ ОСМОТИЧЕСКИ СВОБОДНОЙ ВОДЫ В ПОЧКЕ И ЭНЕРГИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНАЛОГОВ ВАЗОТОЦИНА С V2-РЕЦЕПТОРОМ»

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

УДК 612.460

СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕАБСОРБЦИИ ОСМОТИЧЕСКИ СВОБОДНОЙ ВОДЫ В ПОЧКЕ И ЭНЕРГИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНАЛОГОВ ВАЗОТОЦИНА С ^-РЕЦЕПТОРОМ

© 2011 г. А. В. Кутина*, Т. А. Каравашкина*, Е. И. Шахматова*, Ц. Гао*, Д. Ю. Мордвинцев**,

Д. А. Кузьмин**, В. И. Цетлин**, Ю. В. Наточин*

*Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 Санкт-Петербург, просп. М. Тореза, 44 **Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: natochin@iephb.ru Поступила в редакцию 14.03.2011 г.

Сопоставлены расчетные значения энергии связывания нонапептидов с рецепторами в докинге с их эффектом на реабсорбцию осмотически свободной воды в почке крыс in vivo. Вазотоцин и ряд его аналогов инъецировали ненаркотизированным самкам крыс линии Вистар внутримышечно в дозах от 0.1 пмоль до 0.5 нмоль/кг массы тела на фоне пероральной водной нагрузки (50 мл/кг массы тела). Выявлена значимая корреляция между расчетной энергией взаимодействия пептидов с У2-ре-цепторами и повышением реабсорбции осмотически свободной воды в почке крыс, стимулированной инъекцией нонапептидов. Результаты свидетельствуют о том, что изменения в почке крыс in vivo, вызванные аналогами вазотоцина, находят адекватное отражение при компьютерном моделировании их взаимодействий с У-рецепторами.

Главный эффект вазопрессина на почку млекопитающих заключается в повышении реабсорбции осмотически свободной воды, что приводит к осмотическому концентрированию мочи. Ключевую роль в этом процессе играет повышение проницаемости эпителия собирательных трубок для воды вследствие стимуляции У2-рецепто-ров (Bankir, 2001; Наточин, 2003; Antunes-Rod-rigues et al., 2004) и встраивания аквапорина 2 в люминальную плазматическую мембрану (Agre, 2000; Nielsen et al., 2002). У большинства позвоночных животных гидроосмотический эффект вызван вазотоцином, а у млекопитающих произошла смена нонапептида, и ту же функцию выполняет его аналог — вазопрессин (Mahlmann et al., 1994; Warne et al., 2002). Известны нуклеотидные последовательности, кодирующие различные типы вазопрессиновых рецепторов (Hausmann et al., 1996; Gimpl, Fahrenholz, 2001; Acharjee et al, 2004), и к настоящему времени предложено несколько компьютерных 30-моделей У-рецепто-ров, основанных на рентгеноструктурном анализе кристаллов бычьего родопсина (Mouillac et al., 1995; Phalipou et al., 1999; Tahtaoui et al., 2003; Rodrigo et al., 2007) или бактериородопсина (Thibon-nier et al., 2000). Синтезировано много аналогов нейрогипофизарных гормонов (Kowalczyk et al., 2006; Podstawka et al., 2006; Slusarz et al., 2006; Sobolewski et al., 2007; Кутина и др., 2009; Karavashkina et al., 2011) и проанализировано их

взаимодействие с V-рецепторами в экспериментах in vivo, когда рецепторы встроены в мембраны функционирующих клеток в многокомпонентной системе регуляции организма. В условиях in vivo точной мерой оценки стимуляции ^-ре-цепторов в почке млекопитающих является измерение реабсорбции осмотически свободной воды. Целью данного исследования послужило сравнение эффектов вазотоцина, вазопрессина и их аналогов на реабсорбцию осмотически свободной воды в почке крыс с расчетной величиной энергии связывания этих лигандов с различными подтипами V-рецепторов в докинге и молекулярной динамике. Такой подход позволяет оценить адекватность компьютерного моделирования взаимодействия агониста с рецептором для предсказания его способности стимулировать рецептор в мультикомпонентной системе in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и серии экспериментов. Эксперименты проведены на ненаркотизированных самках крыс линии Вистар с массой тела 150—200 г в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными. Протоколы исследований одобрены этическим комитетом ИЭФБ РАН. Животные содержались в виварии на стандартном пищевом и питьевом режиме. Утром в день эксперимента они не получали

корм при свободном доступе к воде. Аналоги ва-зотоцина и вазопрессина проверяли на антидиуретическую активность в широком диапазоне доз (0.001, 0.01, 0.05 и 0.5 нмоль/кг массы тела) на фоне водной нагрузки. Воду (50 мл/кг) вводили через зонд в желудок. Гормоны и их аналоги растворяли в 0.9%-ном растворе хлорида натрия до различных концентраций (0.001, 0.01, 0.05 и 0.5 нмоль/мл). Раствор, содержащий пептид (число животных n = 6—10 для каждого исследованного пептида в разных дозах), или физиологический раствор вводили внутримышечно в объеме 1 мл/кг сразу после водной нагрузки. Животных помещали в индивидуальные клетки с дном из металлической сетки, сквозь которую моча по воронке собиралась в мерные пробирки. Сбор мочи проводили при спонтанных мочеиспусканиях в течение 4 ч с момента введения пептидов. У контрольных животных в конце эксперимента забирали кровь из сонной артерии под эфирным наркозом. Осмо-ляльность мочи и сыворотки крови определяли криоскопическим методом на микро-осмометре 3300 (Advanced Instruments Inc., США). Диурез и клиренс осмотически свободной воды рассчитывали по стандартным формулам (Наточин, 1997).

Пептиды. В работе использовались следующие пептиды:

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 -вазопрессин;

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 -вазотоцин;

pMpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-DArg-Gly-NH2 -1-дезамино,8-DArg-вазопрессин;

pMpa-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 -1-дезамино-вазотоцин;

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2 -8-DArg-вазотоцин;

pMpa-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2 -1-дезамино,8-DArg-вазотоцин;

Pa-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 - 1-дезамино,1-монокарба-вазотоцин

(pMpa - p-меркаптопропионовая кислота, Pa -пропионовая кислота). Во всех представленных пептидах между N-концевым остатком Cys (или pMpa в этом же положении) и Cys6 находится ди-сульфидная связь.

Вазопрессин, вазотоцин и 1-дезамино,8-DArg-вазопрессин были получены из Sigma Chemical (США). Аналоги вазотоцина были синтезированы ЗАО "Синтез пептидов" (Москва) автоматическим твердофазным методом с использованием Fmoc-технологии (Fmoc - флуоренилметокси-карбонил). Синтез проведен на синтезаторе Applied Biosystems 431А (Германия) по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. После удаления защитных групп и снятия с полимера на следующем этапе удаляли

защитные Acm-группы (ацетоамидометильные группы) с остатков цистеина обработкой ацетатом ртути в 30%-ной водной уксусной кислоте. Затем добавлением аммиака доводили рН до 8 и проводили замыкание дисульфидной связи окислением в присутствии 10-кратного избытка 3%-ного раствора перекиси водорода. Полученные пептиды очищали с помощью обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и проверяли с помощью аналитической ВЭЖХ (степень очистки не менее 98%). Структуру доказывали методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрии.

Построение моделей. Модели рецепторов вазопрессина крысы V1a-, V1b- и У2-типа были построены методом моделирования по гомологии. При построении моделей выравнивание аминокислотных последовательностей было принято таким же, как в базе данных GPCRDB. Моделирование проводилось при помощи программы MODELLER 8v2. Сначала были построены трансмембранные a-спиральные участки белка с использованием структур 1JFP, 1L9H (коды по базе данных Protein Data Bank) и рассчитанных моделей положения трансмембранных доменов для белков такого типа. Внеклеточные участки строили при помощи специальных процедур пакета на основе тех же шаблонных структур, но с большим количеством вариантов, селекция которых проводилась на основании устойчивости в короткой (50 пс) молекулярной динамике в силовом поле GROMOS.

Участки внутриклеточных доменов не строились в связи с отсутствием их значимости для дальнейших расчетов. Сведение полученных частей молекулы рецептора производили в MODELLER с первичной минимизацией структуры собственными инструментами программного пакета. Полученные структуры верифицировали при помощи программы WHAT_CHECK и минимизировали in vacuo в силовом поле CHARMM27 — 300 итераций методом наибольшего снижения потенциальной энергии. Для смоделированной структуры У1а-рецептора было проведено ее встраивание в явно заданную мембрану (256 молекул фос-фатидилхолина в каждом из двух слоев) с добавлением в систему 4800 молекул TIP3P воды, и проведена релаксация молекулярной динамикой в силовом поле GROMOS в GROMACS. Указанная операция была произведена для проверки адекватности модели, построенной in vacuo. Поскольку принципиальных отличий найдено не было (среднеквадратичное отклонение по a-угле-родным атомам цепи между моделями молекул составило 0.93 Á), для дальнейших вычислительных экспериментов были использованы модели in vacuo.

Модели вазотоцина, вазопрессина и их аналогов были построены de novo в PyMOL и Chem3D 2005 Pro (CambridgeSoft, США) и релаксированы in vacuo в полях MM2 и CHARMM при помощи программного пакета TINKER. Правильность построения участка между цистеинами была сверена по имеющимся структурам вазопрессина (например, 1JK4).

Докинг всех структур аналогов вазотоцина проводился в двух различающихся по алгоритму вычисления энергии программах: HEX4.5e и AUTODOCK 3.0.5. Для проверки корректности обнаруженного участка связывания был проведен докинг вазотоцина к У1а-рецептору крысы в программе HADDOCK 1.03, позволяющей осуществлять направленный докинг по известным в литературе биохимическим данным (главным образом, результатам связывания с мутантными рецепторами). Также результаты были воспроизведены докингом в программном пакете GOLD с последующей релаксацией полученных конфор-маций в силовом поле GROMOS. Из восьми полученных конформаций одна была нестабильна в молекулярной динамике и в дальнейшем не учитывалась. Поскольку в результате докинга выявлен тот же участок связывания, что был экспериментально обнаружен методом вычислительных замен аминокислотных остатков в докинге, то для дальнейших рассуждений были использованы результаты именно независимых расчетов.

При докинге использовались

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком