БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 3, с. 183-194
УДК 576.321:582.24
СОПРЯЖЕНИЕ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ PLC И PI3K/PTEN В Physarum polycephalum: ДЕЙСТВИЕ U73122 НА ДВИГАТЕЛЬНУЮ И АВТОКОЛЕБАТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЛАЗМОДИЯ © 2012 г. Н. Б. Матвеева, В. А. Теплов, С. И. Бейлина*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская область; *электронная почта: beylina@iteb.ru Поступила в редакцию 21.10.2011 г.
На плазмодии Physarum polycephalum — многоядерной амебоидной клетке с автоколебательным характером подвижности, изучена возможность сопряжения фосфолипазы С (PLC) с сигнальным путем PI3K/PTEN — универсальным регулятором хемотаксиса и формы свободноживущих амеб и тканевых клеток. Показано, что при сохранении челночного потока протоплазмы и автоколебаний сократительной активности U73122 — ингибитор передачи рецепторного сигнала на фосфолипазу С, вызывает редукцию фронтальной зоны плазмодия, ухудшает локомоторные характеристики клетки, а также подавляет хемотаксис к глюкозе и ответ осциллятора на этот аттрактант. Идентичность этих эффектов с показанными ранее эффектами широко используемых ингибиторов PI3K — ворт-маннина и LY294002 (Matveeva et al. 2008 Biophysics, 53, 533—538), свидетельствует о тесном сопряжении сигнальных путей фосфолипазы C и PI3K/ PTEN. U73122 вызывает увеличение периода колебаний сократительной активности и устраняет характерные для миграции плазмодия циклические изменения его величины, что указывает на наличие рецепторного управления двигательным поведением плазмодия.
Ключевые слова: фосфолипаза С, сигнальный путь Р13К/РТБМ, автоколебания, хемотаксис, миграция, плазмодий Physarum polycephalum.
В вегетативной стадии жизненного цикла мик-сомицет Physarum polycephalum образует плазмодий — многоядерную клетку, формирование которой обусловлено разобщением деления ядер с цитокинезом. Протоплазма плазмодия имеет характерную для амебоидных клеток структуру с гелеобразной стационарной эктоплазмой под мембраной и жидкой текущей эндоплазмой. Структуру эктоплазмы определяют глубокие инвагинации плазматической мембраны, которая образует единый комплекс с актомиозиновым цитоскелетом плазмодия [1]. Компонентами ци-тоскелета являются прикрепленный к мембране сплошной слой параллельно лежащих актиновых филаментов — кортекс, и система радиальных и
Сокращения: PIP2 — фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат; PIP3 — фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфат; IP3 — ино-зит-1,4,5-трисфосфат; IP3R — рецептор инозит-1,4,5-три-сфосфата; PI3K — фосфоинозитид-3-киназа; PTEN — фос-фатидилинозит-3-фосфатаза, гомолог тензина; PLC — фосфолипаза С; PH-домен — белковый модуль, впервые обнаруженный в молекуле плекстрина (pleckstrin homology); С2 домен — белковый модуль в составе молекулы PLC; Ga, GPy — субъединицы тримерного G-белкового комплекса; U73122 — аминостероид 1-{6-[(17р-3-метоксиэстра-1,3,5(10)-триен-17-ил)амино]гексил}-1Н-пиррол-2,5-дион — ингибитор рецепторной активации PLC; LY294002 — ингибитор PI3K.
продольных актомиозиновых фибрилл, которые крепятся к мембране в зоне инвагинаций и поддерживают структуру эктоплазмы [1]. Подобно тканевым клеткам животных, при миграции и таксисах плазмодий принимает полярную треугольную или веерообразную форму. Фронтальная зона за утолщенной кромкой лидирующего края имеет вид пленки, которую пронизывают многочисленные ветвящиеся каналы с текущей эндоплазмой. В более каудальных областях такие каналы трансформируются в протоплазматиче-ские тяжи (вены), древовидная сеть которых заканчивается одиночным хвостовым тяжом.
Подвижность плазмодия имеет автоколебательный характер [2]. Механизм локомоции базируется на возвратно-поступательном течении эндоплазмы в градиенте давления, создаваемого периодическими сокращениями эктоплазмы. Более мощный или более длительный поток в направлении перемещения обеспечивает результирующий перенос массы и миграцию клетки. Колебания сократительной активности сопровождаются синхронными колебаниями внутриклеточной концентрации Са2+, возрастающей до 420 нМ в фазе сокращения и снижающейся до 320 нМ в фазе расслабления [3]. Период автоколебаний меняет-
ся в диапазоне от 1 до 5 мин в зависимости от функционального состояния плазмодия, а также в ответ на внешние стимулы [4].
Способность плазмодия достигать гигантских размеров, оставаясь единой клеткой, а также быстрое восстановление целостности плазматической мембраны у любого плазмодиального фрагмента, существенно упрощают регистрацию механических характеристик сократительного аппарата. Эти уникальные экспериментальные возможности определяют ценность плазмодия P. polycephalum как объекта для исследования динамики сократительного аппарата, природы автоколебаний и волн, характерных для подвижности свободно-живущих амеб и тканевых клеток [5—7], а также консервативности и эволюционной древности управляющих движением сигнальных систем.
Ключевым элементом регуляции направленного движения при хемотаксисе и спонтанной двигательной активности как у миксомицетов, так и у тканевых клеток является накопление в мембране лидирующего фронта фосфатидилино-зит-3,4,5-трисфосфата (PIP3), связывающего с мембраной ряд белков, имеющих РН-домены [8]. В их число входят белки, регулирующие структуру и функциональную активность актомиозино-вого цитоскелета [9], что определяет как движение, так и оптимальную для эффективного перемещения форму мигрирующей клетки. При хемотаксисе процесс накопления PIP3 стимулируется рецепторной активацией фосфоинозитид-3-киназ класса I (PI3K) [9], фосфорилирующих фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат (PIP2) до PIP3, и обращается фосфатидилинозит-3-фосфа-тазой (фосфатаза и гомолог тензина, PTEN), местом связывания которой в плазматической мембране является PIP2 [8, 10].
В плазмодии P. polycephalum ингибирование PI3K не только подавляет хемотаксис, но и устраняет увеличение частоты автоколебаний — характерный для аттрактантов ответ плазмодиального осциллятора на стимул, приложенный ко всей поверхности клетки [11]. Определяющая роль, которую в плазмодиальном осцилляторе играет рецептор инозит-3-трисфосфата (IP3R) [12], увеличение активности PLC при связывании с PIP3, показанное для ее р- и у-изоформ [13], а также то, что PIP2 — субстрат PLC, служит местом связывания PTEN c плазматической мембраной, указывают на возможность сопряжения обоих сигнальных путей. Поскольку такое сопряжение позволяет объяснить отсутствие ответа плазмодиального осциллятора на аттрактант при ингибировании PI3K, в настоящей работе выяснялось, вызывает ли подавление рецепторной активации PLC и другие эффекты ингибиторов PI3K: редукцию фронтальной зоны и устранение двигательного ответа при хемотаксисе. В качестве ингибитора
использован аминостероид 1-{6-[(17р-3-меток-сиэстра-1,3,5(10)-триен-17-ил)амино]гексил}-1Н-пиррол-2,5-дион (U73122) — мощный сульф-гидрильный реагент, подавляющий продукцию IP3 и высвобождение Са2+ из 1Р3-чувствительного пула.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы: глюкоза (Serva, Швейцария), агар (Difco, США), HEPES, вортманнин, U73122 и диметилсульфоксид (DMSO) (Sigma, США). Стоковые растворы (2 мМ) U73122 в DMSO готовили непосредственно перед экспериментом. Стоковый раствор вортманнина хранили при —20°С. При приготовлении агаровых подложек аликвоты стоковых растворов вводили в расплавленный и охлажденный до 50° С 1.5% агар, содержащий 10 мМ HEPES, рН 7.0, и тщательно перемешивали. В контрольных вариантах в подложки вводили DMSO в соответствующей концентрации.
Плазмодий P. polycephalum штамм ВКМ^) 3283 выращивали на агаровых подложках с подкормкой овсяными хлопьями по модифицированному методу [14]. Использованные в экспериментах отрезки тяжей, круглые фрагменты фронтальной пленки и капли протоплазмы изолировали из мигрирующего плазмодия через 12—15 ч после подкормки. Во всех таких фрагментах через 10— 15 с восстанавливается целостность плазматической мембраны [15], а через 15—20 мин — течение протоплазмы и сократительная активность.
Сократительную активность изолированных тяжей регистрировали с помощью высокочувствительного тензиометра [16] по изменениям длины тяжа в изотоническом режиме и изменениям генерируемой тяжами продольной силы в изометрическом. Отрезки изолированных тяжей длиной около 5 мм и диаметром 0.4—0.7 мм прикрепляли к крючкам тензиометра с помощью агара и погружали в кювету с контрольным раствором (10 мМ HEPES, рН 7.0, с добавкой DMSO, соответствующей концентрации ингибитора). Для обработки U73122 тяж переносили в раствор с ингибитором, заменяя кювету.
На распластывающихся и мигрирующих плазмодиях сократительную активность регистрировали модифицированным оптическим методом
[17] по локальным колебаниям толщины и пульсирующим перемещениям края клетки. Экспериментальную камеру с плазмодием фиксировали на столике микроскопа МПС 1, освещали снизу физиологически неактивным красным светом
[18] и помещали так, чтобы изображение выбранного участка клетки проецировалось на отверстие в маске, установленной в фокальной плоскости микроскопа. Для освещения использовали свето-диод LXHL-LD3C (Philips Limited), преимуще-
ством которого является отсутствие инфракрасной составляющей и, как следствие, нагревания объекта. Установка позволяла одновременно измерять локальную сократительную активность в двух участках плазмодия, менять расстояние между участками регистрации (зондами) и визуально оценивать состояние объекта. Образцами служили миниатюрные плазмодии, регенерировавшие из капель протоплазмы, которые помещали на полупрозрачную подложку из папиросной бумаги и переносили в экспериментальную камеру на 1.5 мм слой 1.5% агара с соответствующими цели эксперимента добавками.
Для оценки хемотаксиса использовали простой тест, в котором образцы плазмодия помещают на границу раздела между двумя субстратами и по направлению миграции определяют, какой из них более привлекателен. Тестирование одновременно проводили на агаровых подложках с U73122 и (в контрольном варианте) с DMSO в соответствующей концентрации. В одну из подложек дополнительно вносили аттрактант (1 мМ глюкозы). В качестве образцо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.