научная статья по теме СОПРЯЖЕННЫЙ С ГЛОБИНОМ СЕНСОР И ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СЕТЬ – РЕЦЕПТОРЫ МОНОХРОМАТИЧЕСКОГО СВЕТА В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI Биология

Текст научной статьи на тему «СОПРЯЖЕННЫЙ С ГЛОБИНОМ СЕНСОР И ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СЕТЬ – РЕЦЕПТОРЫ МОНОХРОМАТИЧЕСКОГО СВЕТА В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 2, с. 231-234

^ РАДИАЦИОННАЯ

МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 576.8:539.1.04

СОПРЯЖЕННЫЙ С ГЛОБИНОМ СЕНСОР И ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СЕТЬ -РЕЦЕПТОРЫ МОНОХРОМАТИЧЕСКОГО СВЕТА В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI

© 2007 г. О. А. Тифлова*

Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Троицк

Изучалось влияние излучения Не-№-лазера в широком диапазоне интенсивностей на деление клеток бактерий E.coli в зависимости от дозы светового излучения, времени облучения, а также от содержания цАМФ в исходной культуре. На кривых, отражающих зависимость стимуляции роста бактериальной культуры от дозы света и времени облучения, наблюдалось два максимума: один - для времени облучения около 55 Дж/м2, независимый от времени облучения, второй - около 100 с, независимый от дозы света. Предполагается, что последний отражает кинетические параметры фоточувствительной сигнальной сети, а первый - степень окисления сопряженного с глобином фотосенсора прямого действия - EcDOS-фосфодиэстеразы цАМФ.

He-Ne-лазер, E. coli, фоточувствительная сигнальная сеть, фотосенсор прямого действия, EcDOS-фосфодиэстераза цАМФ.

Красное и ближнее инфракрасное излучение, слабо поглощаемое водным и газовым окружением клеток, может служить для них тонким инструментом спектрального мониторинга окружающей среды. Пути передачи сигнала, используемые клеткой для восприятия и обработки оптической информации, могут быть выявлены при исследовании взаимодействия клеток и тканей с лазерным излучением в широком диапазоне длин волн, доз и интенсивностей. Изучение спектральной и кинетической зависимостей взаимодействия лазерного излучения с клетками бактерий Е.соН позволило очертить круг предполагаемых акцепторов света и сопряженных с каждым из них цепей передачи светового сигнала [1-3]. Однако в сложных системах внешний сигнал, как правило, воспринимается двумя или более клеточными акцепторами, встроенными в метаболическую сеть, а уровень и продолжительность активации зависят не только от величины, но и от длительности сигнала на входе [4]. Цель настоящей работы - на основе исследования зависимости уровня фотостимуляции от дозы лазерного излучения и времени облучения клеток определить, может ли фотовозбуждение иерархически разветвленных метаболических сетей быть причиной устойчивой активации после короткого светового сигнала.

* Адресат для корреспонденции: 142190 Троицк, Московская обл., ул. Пионерская, д. 2, ОПЛТ ИПЛИТ РАН; тел.: (495) 334-03-43; факс: (495) 334-02-01; e-mail: tiflova@ome-ga.laser.ru

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

В экспериментах исследовали влияние на рост бактериальной культуры излучения He-Ne-лазе-ра с длиной волны 632.8 нм при интенсивности света 60, 157 или 3000 Вт/м2. Бактерии E. coli WP2 trp- выращивали в тонком слое богатой питательной среды в течение 16 ч при 37°С без активной аэрации; 1мл такой культуры разбавляли 15 мл солевой среды М9 с добавлением L-триптофана (20 мкг/мл), а также глюкозы или глицерина (по 4 мг/мл) в качестве источников углерода и выращивали без активной аэрации в течение 3 ч [5]. 1 мл полученной культуры облучали в течение 40 с непосредственно в оптически прозрачной среде при интенсивности света 60 Вт/м2 и толщине облучаемого слоя 2 мм. К облученному и контрольному (необлученному) образцу прибавляли по 2 мл теплой (37°С) соответствующей солевой среды и образцы инкубировали при 37°С и толщине слоя 7 мм, определяя количество жизнеспособных клеток в культуре после 0; 0.5; 1 и 2 ч роста.

В экспериментах по определению зависимости эффекта от времени облучения ночную культуру, выросшую на богатой питательной среде, собирали на мембранных фильтрах, промывали 0,05 моль/л К,№-фосфатным буфером и суспендировали в этом буфере до концентрации 2-5 х 108 клеток в мл. Облучали 1 мл такой суспензии при интенсивности света 60 Вт/м2 и толщине слоя 2 мм, затем отбирали 0.3 мл облученной или контрольной (необлученной) культур, засевали в 2.7 мл богатой питательной среды и оставляли для подращи-

Количество клеток в 1 мл культуры (х 107)

30 г

25 -

20 -

15 -

10 -

23 Время после излучения, ч

Рис. 1. Кривые роста контрольных (1,3) и облученных красным светом (2, 4) культур E. coli, выращенных с добавлением глицерина (1, 2) или глюкозы (3, 4).

Соотношение числа клеток в облученной и необлученной культурах

3

0

0.001 0.01

0.1

10

100 1000 Время, с

Рис. 2. Зависимость уровня стимуляции роста бактерий от времени облучения красным светом с интенсивностью 3000 Вт/м2 (1), 157 Вт/м2 (2) или 60 Вт/м2 (3).

вания при 37°С в течение 1 ч (толщина слоя 7 мм). Для облучения бактерий светом с интенсивностью 157 или 3000 Вт/м2 была использована специальная кварцевая кювета диаметром 2.8 мм. Поскольку при высокой интенсивности лазерного излучения диаметр светового пятна не превышал 3 мм, толщина слоя суспензии составляла в этом случае 14 мм. 0.05 мл облученной в фосфат-

ном буфере или контрольной (необлученной, но находившиеся в кювете соответствующий период времени) культуры разбавляли в отношении 1 : 10 в свежей богатой питательной средой и инкубировали при 37°С в течение 1 ч при толщине слоя 3.5 мм.

Количество жизнеспособных клеток определяли стандартным методом по их способности образовывать колонии на твердой питательной среде. Эксперименты проводились при слабом естественном освещении. Результаты приставляли графически. Каждая точка на кривой отражает средние из 3-5 экспериментов по 3 повторности в каждом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Были исследованы кривые роста культур Е.со-И, выросших на минимальной солевой среде с добавлением глюкозы или глицерина в качестве источника углерода. Как следует из данных, представленных на рис. 1, рост глюкозной культуры в логарифмической фазе роста не изменяется после облучения красным светом Не-№-лазера (кривые 3 и 4). Глицериновая культура в ответ на облучение ускоряет свой рост на 30-40% (кривые 1 и 2), приближаясь по скорости к глюкозной, причем сорокасекундный световой сигнал обеспечивает эффект стимуляции роста в течение более чем одной генерации.

В экспериментах по изучению формы кривых, отражающих зависимость уровня стимуляции роста бактериальной культуры от величины сигнала (дозы лазерного излучения) и его длительности (времени лазерного облучения) исследовали влияние на деление бактерий лазерного света, различающегося по интенсивности в 50 раз. Времена облучения изменялись в широких пределах; для света с интенсивностью 60 Вт/м2 от 0.125 до 720 с; для света с интенсивностью 157 Вт/м2 от 0.034 до 300 с; для света с интенсивностью 3000 Вт/м2 от 0.004 до 720 с. Как следует из данных, представленных на рис. 2 и 3, все кривые, отражающие зависимость отношения количества клеток в облученных и необлученных образцах как от времени облучения, так и от дозы света, имеют два отчетливо выраженных максимума. При интенсивности света 3000 Вт/м2 максимальная стимуляция, достигающая 100%, наблюдается при облучении клеток в течение 0.017 и 100 с (кривая 1, рис. 2), что соответствует дозам 54 и 3 х х 105 Дж/м2 (кривая 1, рис. 3). Для света с интенсивностью 157 Вт/м2 оптимальные времена облучения составляют 0.4 и 100 с (кривая 2, рис. 2), оптимальные дозы - 62 и 1.6 х 104 Дж/м2 (кривая 2, рис. 3); а для света с интенсивностью 60 Вт/м2 -1 и 100 с (кривая 3, рис. 2) и 60 и 6 х 103 Дж/м2 (кривая 3, рис. 3). Характерной особенностью полученных кривых является наличие независимого

2

1

1

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ том 47 < 2 2007

СОПРЯЖЕННЫЙ С ГЛОБИНОМ СЕНСОР

233

Соотношение числа клеток в облученной и необлученной культурах

Зг

1 100 10000 1000000

Доза света, Дж/м2

Рис. 3. Зависимость уровня стимуляции роста бактерий от дозы излучения с интенсивностью 3000 Вт/м2 (1), 157 Вт/м2 (2), 60 Вт/м2 (3).

от дозы излучения временного максимума около 100 с (рис. 2), а также независимой от времени облучения в изученных пределах изменения величины интенсивности излучения оптимальной дозы около 55 Дж/м2 (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Сложный вид кривых "доза-эффект" позволяет предположить участие двух или более каналов восприятия клеткой внешнего светового сигнала. Существование независимой от времени облуче-

ния, определяемой только дозой облучения (рис. 3) биостимуляции позволяет предположить наличие в клетках E.coli фотосенсора прямого действия, в котором поглощающий свет регуляторный домен передает сигнал непосредственно в каталитический домен фермента. Недавно в клетках бактерий E. coli обнаружен Direct Oxygen Sensor (Ec-DOS) белок, который наряду с более чем двумя десятками генетически родственных ферментов микроорганизмов и растворимой гуанилатцикла-зой млекопитающих входит в семейство сопряженных с глобином сенсоров, регулирующих клеточный метаболизм на уровне циклических нук-леотидов цАМФ и цГМФ [6]. Сенсорный домен в таких белках содержит гем, спектр поглощения которого хорошо согласуется со спектром действия лазерного излучения на клетки E. coli [1]. Поглощение EcDOS белка в области 630 нм составляет около 2 ммоль-1 см-1 в окисленном состоянии [7]. Восстановление гема, сопровождающееся существенным снижением поглощения, переводит каталитический домен в конформацию активной фосфодиэстеразы цАМФ [8]. Можно предположить, что фотовосстановление N-кон-цевого сенсорного домена передает фотосигнал непосредственно в каталитический C-концевой фосфодиэстеразный домен, сдвигая равновесие в сторону распада цАМФ, что, как известно, приводит к выключению позитивного контроля экспрессии индуцибельных оперонов и запуску нового цикла деления [9]. Поскольку в присутствии глюкозы концентрация цАМФ снижается [9], на-

HAДH ^ A™\

l )

ЛТФ^Ф Ц^Ф

Рис. 4. Схема фрагмента фоточувствительной сигнальной сети в клетках бактерий E. coli. РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ том 47 < 2 2007

2

2

l

блюдаемое в наших экспериментах отсутствие реакции на лазерное излучение бактериальной культуры, выросшей на минимальной среде с глюкозой (рис. 1), не противоречит такой гипотезе. Таким образом, можно отметить положительную корреляцию между лазерной биостимуляцией и присутствием в бактериальной кл

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»