НЕИРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 4, с. 309-316
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.821+577.352
СОПРЯЖЕНЫЕ ПРОЦЕССЫ НЕИРОГЛИОГЕНЕЗА И АПОПТОЗА
В ЗРЕЛОМ МОЗГЕ У КРЫС
© 2008 г. В. В. Шерстнев, В. В. Юрасов, 3. И. Сторожева, М. А. Грудень*
ГУ Институт нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМН, Москва
Проведено одновременное определение содержания маркера нейроглиогенеза - 5-бромо-2-дезок-сиуридина (BrdU) в нативной и фрагментированной ДНК, а также активности маркеров апоптоза -каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК - в мозжечке, гиппокампе и коре мозга взрослых крыс спустя 24 ч, 14 и 30 дней после введения BrdU. В исследованных церебральных структурах выявлены различия в динамике и выраженности показателей нейроглиогенеза и апоптоза. Обнаружены корреляции между процессами пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели "новых" и "старых" клеток в зрелом мозге. Обсуждается положение о структурно-функциональной сопряженности нейроглиогенеза и апоптоза.
Ключевые слова: зрелый мозг, нейрогенез, глиогенез, апоптоз, BrdU, пролиферация, активность каспазы 3, фрагментация ДНК.
ВВЕДЕНИЕ
Многочисленными экспериментальными данными подтверждено положение о том, что процессы нейроглиогенеза, пролиферации, миграции и дифференцировки нервных и глиальных клеток, а также их генетически программируемой гибели - апоптоза - протекают в течение всей жизни индивидуума и рассматриваются в качестве основы формирования и обеспечения функций мозга [1-6].
С помощью различных методов и подходов получены убедительные свидетельства о широкой региональной распространенности нейроглиоге-неза в зрелом мозге человека, млекопитающих, амфибий, рептилий, ракообразных и насекомых. У взрослых млекопитающих "новые" клетки активно образуются во многих отделах головного мозга: субвентрикулярной зоне боковых желудочков, зубчатой извилине гиппокампа, обонятельных луковицах, некоторых областях коры, амигдале, гипоталамусе, септуме, хвостатом ядре, черной субстанции и коре мозжечка [7-11].
Установлено, что более половины вновь образованных в пре- и постнатальном онтогенезе нервных и глиальных клеток погибают путем апоптоза. Показано, что клеточная гибель инициирует нейрогенез и избирательно влияет на образование определенного типа нейронов [12-14].
Взаимосвязанные изменения нейроглиогенеза и апоптоза продемонстрированы в мозге зрелых
* Адресат для корреспонденции: 125009, Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4; тел: (495) 6925337; e-mail: sherstnev@inbox.ru
животных при обучении и формировании различных форм памяти. Документировано, что направленность и выраженность этих изменений зависят от "возраста" клеток мозга (степени зрелости "новых" клеток), стадии обучения и этапа формирования памяти [1, 15, 16]. Нарушение нейроапо-птоза, как правило, сопровождаются выраженными модификациями процессов пролиферации и дифференцировки нервных клеток [13, 17]. В настоящее время также показана тесная связь между молекулярными механизмами и регуля-торными факторами развития и гибели нейронов в зрелом мозге [1, 5]. Таким образом, не вызывает сомнения факт функционального, структурного и "молекулярного" взаимодействия между этими двумя фундаментальными процессами, протекающими в мозге. Их изучение имеет не только теоретическую, но и прикладную значимость для разработки новых подходов диагностики и лечения заболеваний нервной системы. Вместе с тем, экспериментального исследования и анализа взаимосвязи между неонейрогенезом и нейроапопто-зом ранее не проводилось.
В выполненной нами работе изучали сопряженность процессов нейроглиогенеза и апоптоза в зрелом мозге. Одновременно определяли показатели нейроглиогенеза - включение маркера пролиферации 5-бромо-2-дезоксиуридина (ВгШ) в ДНК клеток, а также биохимических маркеров апоптоза - активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в мозжечке, гиппокампе и префронтальной коре мозга у половозрелых крыс через различное время после системного введения Вгёи.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Wistar (n = 21) 3-месячного возраста и массой 200-220 г. Животных содержали по 4 особи в клетках со свободным доступом к воде и пище при постоянной комнатной температуре 22°С и регулярном световом цикле (включение света в 8:00, выключение в 22:00). Время проведения опытов с 11:00 до 15:00. Маркер пролифератив-ной активности клеток - 5-бромо-2-дезоксиури-дин (BrdU) вводили внутрибрюшинно 3 раза с интервалом в 30 мин по 50 мг/кг веса в 500 мкл физиологического раствора (суммарная доза 150 мг/кг). Через 1, 14 и 30 сут после введения BrdU крыс декапитировали и при 4°С выделяли структуры мозга крыс: гиппокамп (левый), префрон-тальную кору (слева) и мозжечок (срединный горизонтальный фрагмент, проходящий через оба полушария и червь). Использование в работе левого гиппокампа и префронтальной коры левого полушария обосновано полученными ранее данными о латерализации процессов программируемой гибели клеток гиппокампа и коры мозга в механизмах обучения и памяти [18].
Из выделенных структур мозга после первичной экстракции и центрифугирования получали фракцию супернатанта, которую использовали для определения активности каспазы 3 и определения содержания белка методом, описанным нами ранее [19]. Осадок, полученный после центрифугирования, отдельно диспергировали в буферах для экстрагирования нативной и фрагментированной ядерных ДНК. Нативную ДНК выделяли в модифицированном авторами буфере составом: 1 М NaCl, 50 мМ Tris, 5 мМ CHAPS, 5 мМ дитиотриетола, 20 мМ ЭДТА, 5% ПЭГ, 2%-ный нонидет NP-40 и 1%-ный дезоксихо-лат натрия, рН = 8.0 по известному методу [20]. Фрагментированную ДНК выделяли по методу, разработанному нами ранее [19]. Гомогенат центрифугировали при 8000g, 20 мин при 4°С. Гидролиз белков в супернатанте, осаждение и очистку нативной и фрагментированной ДНК, а также определение межнуклеосомальной фрагментации ДНК методом электрофореза в агарозном геле проводили, как описано в нашей предыдущей статье [19].
Выявление BrdU в образцах нативной и фрагментированной ДНК проводили классическим методом Вестерн дот-блота на нитроцеллюлоз-ной мембране с использованием мышиных моно-клональных антител к BrdU (Sigma, США), био-тинилированных антимышиных антител (Sigma, США), системы конъюгированного со щелочной фосфатазой стрептавидина (Sigma, США) в присутствии хромогена нитротетразолиевого синего [21, 22]. Количество BrdU, включившегося в ДНК, оценивали по интенсивности окраски дот-
блота хромогеном после сканирования. Анализ сканированного видеоизображения проводили в программе ImageProPlus 3.0 (Media Cybernetics,USA). Результаты анализа выражали в виде интегральной оптической плотности в пересчете на 1 мкг ДНК и 1 мг массы ткани для каждой из исследованных структур мозга (ИОП/мкг ДНК/мг ткани). В образцах, проанализированных методом дот-блота, концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически при 260 нм на спектрофотометре Becman DU-70 (Becman,USA).
Статистическую обработку результатов осуществляли в программе STATISTICA 6.0. Для сравнения выборок с нормальным распределением и гомогенными дисперсиями применяли ANOVA. При сомнительной нормальности для сравниваемых выборок использовали непараметрические методы анализа: тест Манна-Уитни при равномерности дисперсий и Вальда-Вольфовица при их неоднородности. Нормальность распределения оценивали в тесте Шапиро-Уилка, а гомогенность дисперсий в тесте Левене.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Оценку включения BrdU в ДНК проводили как для нативной ДНК, так и для фрагментированной ДНК, которые выделяли из одного образца с применением поэтапной экстракции указанных типов нуклеиновых кислот. Это позволило комплексно охарактеризовать динамику неонейро-глиогенеза и неоапоптоза в отдельных структурах зрелого мозга крыс.
Обнаружено, что через сутки после введения BrdU уровень включенной метки во фракции нативной ДНК ядер клеток, вступивших в деление (процесс "неонейроглиогенеза), был сходным во всех исследованных структурах мозга - гиппокам-пе, коре и мозжечке (табл. 1). Спустя 14 дней наиболее выраженный уровень включения BrdU в нативную ДНК отмечался в мозжечке: в 1.5 раза выше, чем в гиппокампе и коре мозга. Количество BrdU через 30 дней после введения метки было максимальным в гиппокампе, превышая в 2 раза таковое в сравнении с мозжечком и в 4 раза - с корой мозга (р < 0.05). Через 14 дней после введения BrdU наблюдали достоверное по сравнению с 1 сут снижение его содержания в нативной ядерной ДНК в гиппокампе (р < 0.05) и тенденцию к увеличению содержания включенной метки в клетках мозжечка. Анализ включения BrdU в нативную ядерную ДНК через 30 сут в сравнении с 1 сут после его введения показал, что метка обнаруживалась в гиппокампе в количестве возросшем четырехкратно (р < 0.05), а в мозжечке - двукратно (р < 0.05), при этом оставаясь на прежнем уровне в коре (табл. 1).
Таблица 1. Включение ВМи (ИОП/мкг ДНК/мг ткани, М ± Б.Е.М) в нативную ДНК клеток, в исследованных структурах мозга половозрелых крыс
Срок после введения ВМи, дни Отделы мозга
гиппокамп кора мозжечок
1 1 01 ± 1 5.1 82.2 ± 7.6 85.9 ± 27.5
14 61.58 ± 20.16+ 56.95 ± 17.31+ 108.98 ± 2.32
30 401 ± 69.3*' ** 92 ± 15.8 186.6 ± 32.8*, х
Примечание. * р < 0.05 - достоверность различий по сравнению с префронтальной корой на 30-дневный срок после введения Вгёи (критерий АКОУА); + р < 0.05 - достоверность различий по сравнению с мозжечком на 14-дневный срок после введения Вгёи (критерий АКОУА). ** р < 0.05 - достоверность различий в гиппокампе у животных по сравнению со сроками 1 и 14 сут после введения ВМи (критерий АКОУА); х р < 0.05 - достоверность различий в мозжечке у животных по сравнению со сроками 1 и 14 сут после введения Вгёи (критерий Манна-Уитни).
Таблица 2. Включение ВМИ (ИОП/мкг ДНК/мг, М ± Б.Е.М.) во фрагментированную ДНК клеток в структурах мозга половозрелых крыс
Срок после введения ВМи, дни Структуры мозга
гиппокамп кора мозжечок
1 52.8 ± 17.7 62.9 ± 24.6 53.4 ± 15.5
14 51.86 ± 6.21х 53.11 ± 17.72х 129.25 ± 16.54**
30 77.1 ± 17.3*, ** 47.2 ± 27.6 85.4 ± 26.5*, **
Пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.