ФИЗИКОХИМИЯ ПОВЕРХНОСТИ И ЗАЩИТА МАТЕРИАЛОВ, 2014, том 50, № 6, с. 640-644
ПРОЦЕССЫ РАЗДЕЛЕНИЯ НА МЕЖФАЗНЫХ ГРАНИЦАХ. ХРОМАТОГРАФИЯ
УДК 543.054;543.544
СОРБЦИОННОЕ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ФЕНИЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (БИОМАРКЕРОВ СЕПСИСА) ИЗ МОДЕЛЬНЫХ РАСТВОРОВ
НА СВЕРХСШИТОМ ПОЛИСТИРОЛЕ © 2014 г. А. К. Паутова, А. И. Ревельский
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3 e-mail: alicepau@mail.ru, sorbent@yandex.ru Поступила в редакцию 28.04.2014 г.
Разработаны условия сорбции (на сверхсшитом полистироле) шести фенилкарбоновых кислот (ФКК), являющихся биомаркерами сепсиса, из водных модельных растворов и условия элюирова-ния этих кислот с сорбента для последующих дериватизации и анализа методом газовой хроматографии—масс-спектрометрии (ГХ—МС). Условия позволяют обнаруживать ФКК в растворе на уровне (и ниже) содержания этих соединений в сыворотке крови здоровых пациентов. Групповое извлечение различающихся по полярности искомых кислот из водных растворов проведено селективно по отношению к холестерину, выбранному в качестве своеобразного маркера более высоко-кипящих мешающих соединений. Применение разработанной методики эксперимента позволит значительно повысить экспрессность анализа для диагностики сепсиса на ранних стадиях развития.
DOI: 10.7868/S0044185614060151
ВВЕДЕНИЕ
Исследование метаболома в настоящее время является тенденцией в медицине, химии, биологии и многих других областях наук [1], поскольку метаболом отражает жизнедеятельность клеток и процессы, происходящие на уровне генома, транскриптома и протеома [2] и открывает возможность зафиксировать изменения в фенотипе, что, в свою очередь, поможет в диагностике заболеваний на ранних стадиях развития. Открытие биомаркеров различных заболеваний и расстройств и включение их в разработку клинических решений может впоследствии кардинально изменить процедуру оказания медицинской помощи, поэтому существует большая потребность в открытии, оценке и клинической проверке биомаркеров.
Несмотря на стремительное развитие медицины, серьезной проблемой и сейчас является диагностика сепсиса на ранних стадиях развития заболевания. Количество летальных исходов при сепсисе остается на высоком уровне [3], что требует проведения быстрых и достоверных анализов для постановки точного диагноза. Определение ФКК, которые являются продуктами жизнедеятельности бактерий, вызывающих сепсис, является новым подходом к диагностике сепсиса на ранних стадиях развития [4]. Этими кислотами являются: 2-фенил-уксусная кислота (ФУК), 3-фенилпропановая кислота (ФПК), 3-фенилмолочная кислота (ФМК), 2-(4-гидроксифенил)уксусная кислота (ГФУК), 3-(4-гидроксифенил)пропановая кис-
лота (ГФПК), 3-(4-гидроксифенил)молочная кислота (ГФМК). Проведенные группой профессора Белобородовой Н.В. исследования показали, что содержание этих кислот в крови септических больных меняется в 10—100 раз по сравнению с их содержанием в крови здоровых людей [5]. На основании этих данных разработан и успешно применяется в настоящее время патент на определение ФКК в сыворотке крови методом ГХ—МС [6]. Основной сложностью при проведении анализа является работа с сывороткой крови, которая представляет собой сложную смесь высоко- и низкомолекулярных компонентов разной концентрации. Используемая в настоящее время пробоподготовка включает в себя жидкость-жидкостную экстракцию органическими растворителями с высаливанием. Несмотря на приемлемые результаты по извлечению кислот, метод достаточно трудоемкий и длительный. Кроме того, не удается полностью избавиться от ряда мешающих соединений, например холестерина, попадание которого в хроматографическую систему ведет к ее загрязнению, искажению результатов и значительному увеличению времени анализа. В настоящей работе для повышения селективности группового извлечения ФКК и экспрессности анализа рассматривается использование другого метода про-боподготовки — сорбционного концентрирования, который позволяет автоматизировать пробо-подготовку и проводить ее одновременно для большого количества проб.
CОРБЦИОННОE KОНЦEНTРИРОBAНИE ФЕНИЛЕАРБОНОВЬК KИCЛОT 641
Широкий выбор существующих сорбентов позволяет проводить селективное извлечение разных по природе соединений и классов соединений, что обуславливает активное использование сорбционного концентрирования в пробоподго-товке и постепенное вытеснение жидкость-жидкостной экстракции [7]. Разработанный в 70-х годах профессором Даванковым В.А. сверхсшитый полистирол представляет особый интерес в настоящее время [8]. Благодаря своей особой структуре (наличию микро- и макропор) и химической природе его все чаще используют для извлечения органических соединений из различных объектов, в том числе из сточных вод [9], продуктов питания, а также из биологических объектов — мочи, крови и слюны [10, 11]. Наличие этих данных позволило предположить, что сорбционное концентрирование на патронах со сверхсшитым полистиролом в качестве сорбента позволит провести селективное (по отношению к загрязняющим аналитическую систему компонентам матрицы) групповое извлечение ФКК из сыворотки крови. Далее предполагается провести дериватизацию выделенных компонентов и определение их триметилсилильных (ТМС) производных методом ГХ—МС.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты и материалы. В работе использовали ФУК, ФПК, ФМК, ГФУК, ГФПК, ГФМК, холестерин производства "Sigma-Aldrich", сверхсшитый полистирол Purosep-270 производства "Puro-lite" , ^0-бис(триметилсилил)трифторацетамид (БСТФА) производства "Regis Technologies", ме-тил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ) производства "Scharlau Chemie S.A.", ацетон (х.ч. для хроматографии) производства "Компонент-реактив".
Приготовление модельного раствора ФКК и холестерина. Модельный раствор готовили путем растворения 1—4 мг ФКК и 4 мг холестерина в 1 мл ацетона; аликвоту 20 мкл полученного раствора растворяли в 1 мл ацетона, и аликвоты (20 мкл) использовали в экспериментах с определением ТМС производных на капиллярной колонке НР-1 длиной 7 м. Концентрации ФКК составили 2 х 10-5—8 х 10-5 г/мл, концентрация холестерина — 8 х 10-5 г/мл.
Условия сорбционного концентрирования на сверхсшитом полистироле. При подборе оптимальных условий сорбционного концентрирования ФКК из водных модельных растворов варьировались следующие параметры: природа элюента (ацетон, МТБЭ), объем элюента (6 х 200 мл, 2 х 600 мл), экстракция из водного и кислого (1 х 10-2 М раствор серной кислоты) растворов, промывание сорбента дистиллированной водой и раствором серной кислоты (5 х 10-5 М и 1 х 10-4 М). Наилучшие результаты получены при следующих условиях эксперимента: нанесение водного раствора ФКК и
холестерина на картридж с 300 мкл сверхсшитого полистирола, промывание сорбента 3 мл раствора серной кислоты (5 х 10-5 М), высушивание сорбента при давлении 170 мм рт. ст., добавление 600 мкл МТБЭ на 5 мин, элюирование еще 600 мкл МТБЭ. После этого элюат собирают в ви-алу, высушивают в потоке азота (80 мл/мин) до объема 300 мкл, дериватизируют (30 мкл БСТФА, 60 мин при 60° С), охлаждают до комнатной температуры, затем высушивают досуха в потоке азота (80 мл/мин), добавляют к сухому остатку 50 мкл МТБЭ и 1 мкл полученного раствора анализируют методом ГХ—МС. После окончания каждого эксперимента сорбент промывали ацетоном и раствором серной кислоты (1 х 10-2 М), чтобы провести его регенерацию.
Условия анализа методом ГХ—МС. В работе использовали хроматомасс-спектрометр фирмы Trace Electron Corporation, включающий газовый хроматограф Trace GC Ultra и масс-спектральный детектор Trace DSQ. Хроматографическое разделение компонентов проводили на кварцевой капиллярной колонке Restek RTX-1ms (100% диме-тилполисилоксан, толщина неподвижной фазы 0.25 мкм, длиной 30 м, внутренним диаметром 0.32 мм) и кварцевой капиллярной колонке HP-1 (100% диметилполисилоксан, толщина неподвижной фазы 0.11 мкм, длиной 7 м, внутренним диаметром 0.2 мм). Условия хроматографического разделения: температура инжектора — 250°С, расход газа-носителя — 1.5 мл/мин, режим без деления/с делением потока, время от ввода пробы до включения делителя потока (1 : 20) — 0.5 мин. Режим программирования температуры термостата колонок: начальная температура — 40°С, время выдержки термостата при этой температуре — 5 мин, скорость нагрева — 20°С/мин до 260°С, время выдержки — 10 мин. Объем вводимой пробы — 1 мкл. Условия масс-спектрального анализа: электронная ионизация, энергия электронов — 70 эВ, температура интерфейса — 260°С, температура ионизацинной камеры — 250°С, давление в камере — 10-5 мм рт. ст., диапазон сканирования m/z — 50—480а.е.м., скорость сканирования — 4 скана в секунду, задержка включения катода — 7 мин.
Перед проведением экспериментов по изучению полноты сорбции и десорбции ФКК с сорбента провели эксперименты по дериватизации кислот и анализу растворов полученных производных. Площади полученных хроматографиче-ских пиков использовали в дальнейшем для оценки полноты извлечения определяемых веществ в процессе пробоподготовки, основанной на сорб-ционном концентрировании. Вначале работы использовалась капиллярная колонка длиной 30 м, и время ГХ—МС анализа составляло 30 мин. Впоследствии колонка была заменена на более короткую (7 м), и время анализа составило 15 мин.
б ФИЗИKОXИMИЯ ПОBEРXНОCTИ И MATEРИAЛОB том 50 № 6 2014
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Помимо аналитического выхода — методики эксперимента по определению указанных кислот в образцах сыворотки крови методом ГХ—МС — промежуточный научный и практический интерес представляла следующая стадия эксперимента. Необходимо было обеспечить групповое извлечение этих разных по полярности ФКК из модельных водных растворов селективно по отношению к компонентам матрицы (сыворотки крови), мешающим определению данных кислот методом ГХ—МС. Мешающие компоненты матрицы загрязняли хрома-тографическую систему и масс-спектральный детектор и требовали, как минимум, длительного времени нагрева термостата колонок при максимально приемлемых для колонки температурах, дополнительных контрольных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.