ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 6, с. 664-669
УДК 579.66.222.2:628.35
СОРБЦИЯ ГЛИФОСАТА И ЕГО МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ В ПОЧВЕННЫХ СУСПЕНЗИЯХ
© 2009 г. Т. В. Шушкова*, Г. К. Васильева**, И. Т. Ермакова*, А. А. Леонтьевский*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290
e-mail: tanya_vsh@rambler.ru **Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, 142290
Поступила в редакцию 11.08.2008 г.
Изучена сорбция и микробная деструкция глифосата, действующего вещества гербицида Граунд Био, в суспензии дерново-подзолистой и серой лесной почв. В соответствии с величинами емкости поглощения (3560 и 8200 мг/кг, соответственно) и константами уравнения Фрейндлиха (Kf, 15.6 и 18.7, соответственно) эти почвы обладали сравнительно высокой сорбционной способностью по отношению к гербициду. Сорбированный глифосат представлен экстрагируемой и связанной (неэкстрагируемой) фракциями, соотношение которых после длительного инкубирования стерильных суспензий достигало 2 : 1 в дерново-подзолистой и 1 : 1 в серой лесной почве. При инокулировании нативной суспензии дерново-подзолистой почвы клетками селекционированного штамма-деструктора Ochrobactrum anthropi GPK 3, общее содержание глифосата (растворенного и экстрагируемого) снизилось на 25.4%, тогда как в неинокулирован-ной суспензии убыль не превышала 5.5%. Впервые продемонстрирована возможность использования селекционированного штамма бактерий для интенсификации процессов деструкции глифосата в почвенных системах.
Объем гербицидов, применяемых в сельском хозяйстве, ежегодно возрастает. Одними из наиболее распространенных являются неселективные по-слевсходовые гербициды на основе глифосата (ГФ, ^-фосфонометилглицин), используемые для уничтожения однолетних и многолетних сорняков. ГФ представляет собой двухзарядный ион НООС-СН2-К+Н2-СН2-РО(ОН)О-. Это высоко полярное, хорошо растворимое в воде химическое соединение.
Считается, что ГФ умеренно устойчив в почве, однако имеющиеся данные о скорости его деградации противоречивы. Период полуразложения гербицида (Т50) может колебаться от 6 до 280 сут, а его остаточные количества обнаруживали в почве через 2 года после обработки [1-3], что может быть следствием высокой сорбционной способности ГФ и накопления связанной фракции [4, 5]. ГФ сорбируется почвой преимущественно за счет взаимодействия фосфоновой группы с гуминовыми кислотами, почвенными минералами и гидроокислами металлов (Бе, А1 и др.) подобно сорбции минеральных фосфатов. Интенсивность протекания этого процесса зависит от исходной концентрации гербицида, химического состава почв и ряда других факторов [2, 6].
Присутствие ГФ в почве может оказывать прямое токсическое воздействие на микроорганизмы (микромицеты, азотфиксирующие бактерии и др.),
что выражается в замедлении их роста и снижении численности [7, 8].
Органофосфонаты устойчивы к физико-химическим воздействиям (гидролиз, фотолиз), но могут подвергаться разложению ферментными системами микроорганизмов путем разрыва С-Р связи. Среди них известны и бактериальные штаммы-деструкторы ГФ, чаще всего выделяемые из почв, загрязненных такими веществами. Они используют ГФ в качестве единственного источника фосфора, но не азота или углерода [9-11]. Биопрепараты на основе таких культур могут найти применение при биоремедиации почвы, загрязненной ор-ганофос-фонатами, к числу которых наряду с гербицидами относятся и продукты детоксикации отравляющих веществ (зарин, зоман). Однако для корректной оценки возможности биодеградации этих химикатов в почве необходимо знать вклад сорбции токсиканта, снижающей скорость его разложения в процессе инактивации [1, 12].
Цель работы - изучение динамики сорбции ГФ в составе препарата Граунд Био дерново-подзолистой (ДП) и серой лесной (СЛ) почвами, а также возможности его деградации селекционированным штаммом-деструктором в условиях почвенной суспензии.
МЕТОДИКА
В качестве источника ГФ использовали препарат Граунд Био ("Техноэкспорт", Россия), где действующим веществом является его изо-пропил-аминная соль этого органофосфоната.
Исследования проводили со свежеотобранными в окрестностях г.г. Серпухова и Пущино (Московская обл.) образцами незагрязненных почв: ДП средне-суглинистой с содержанием Сорг 1%, глины 39.8%, обменного фосфора 4.5 мг Р^Ш г, рН 7.1 и СЛ легкоглинистой с содержанием Сорг. 1.6%, глины 54.5%, обменного фосфора 17.5 мг Р205/100 г, рН 7.0.
Процесс биодеградации ГФ в почвенной суспензии изучали с использованием бактериального штамма ОсНтоЪаМтит аШНгор1 GPK 3, выделенным авторами статьи методом накопительных культур из почвы, в которую многократно вносили гербицид Раундап, содержащий этот органо-фосфонат [11].
Динамику сорбции ГФ изучали в стерильных почвенных суспензиях при исходной концентрации гербицида в воде 2000 и 500 мг/л. Почвенные суспензии готовили следующим образом: почву просеивали через 2 мм сито, 25 г образца стерилизовали паром (1 ч, 1 атм), смешивали со 100 мл стерильного раствора ГФ в дистиллированной воде и инкубировали в конических 750-мл колбах при 30°С в стационарных или динамических (при встряхивании) условиях на качалке (200 об/мин) в течение 30 сут.
В ходе эксперимента периодически анализировали содержание ГФ в разных фракциях суспензии. Для изучения распределения ГФ твердую и жидкую фазы разделяли центрифугированием (5200 g, 15 мин). В жидкой фазе (супернатанте) определяли концентрацию растворенного ГФ (Ср, мг/л). Содержание сорбированного твердой фазой ГФ (Сс, мг/кг) рассчитывали по формуле О- = (С0 - Ср)/0.025, где С0 - его исходная концентрация в растворе. Концентрацию экстрагируемого ГФ в твердой фазе (Сэ, мг/кг) оценивали по методике [13]. Для этого осадок встряхивали с 70 мл 1 н. NaOH в течение 30 мин, центрифугировали (5200 g, 15 мин) и анализировали су-пернатант на содержание ГФ. Долю связанного гербицида (Ссв, мг/кг) рассчитывали по формуле Ссв =
= Сс — Сэ.
Для построения изотерм адсорбции ГФ почвами использовали водные растворы с исходной концентрацией вещества от 50 до 7000 мг/л. Суспензии центрифугировали (5200 g, 15 мин) после встряхивания в течение 1 сут и определяли содержание растворенного и сорбированного ГФ. Для численной характеристики процесса сорбции гербицида почвами полученные изотермы аппроксимировали с помощью уравнения Фрейндлиха: О- = КСр1/и, где Ср и Сс -
равновесные концентрации растворенного и сорбированного ГФ, a Kf и 1/n - постоянные, которые позволяют оценить сорбционную емкость и интенсивность процесса поглощения токсиканта, соответственно.
Количественное определение ГФ в растворах и экстрактах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе "LKB 2150" (Швеция) с УФ-детектором (204 нм), колонкой Repro-Gel H ("Dr. Maisch", Германия), 9 мкм (250 х 8 мм) при 65°С. Подвижная фаза: 0.01 N серная кислота. Очистку экстрактов от гуминовых кислот осуществляли путем их осаждения 20%-ной серной кислотой (0.2 мл/мл экстракта) с последующим отделением осадка центрифугированием (10000 g, 10 мин) и пропусканием супернатанта через фильтр с размером пор 0.22 мкм "MF-Millipor" (США).
Штамм-деструктор выращивали на минеральной среде MS1 [11] с ГФ (500 мг/л), клетки подвергали 2-суточному голоданию по фосфору, центрифугировали (5200 g, 30 мин), промывали 2 раза минеральной средой без фосфора и суспендировали в той же среде. Биомассу вносили в суспензию, приготовленную из стерильной или нестерильной ДП почвы и жидкой минеральной среды MS1 с ГФ (500 мг/л), который рассматривался в качестве единственного источника фосфора, хотя не исключалось также и потребление растворимых фосфатов в составе самой почвы. Исходная концентрация клеток в суспензии составляла 1-2 х 108 кл./мл.
Источник углерода в почвенную суспензию не вносили, основываясь на результатах предварительных экспериментов, показавших, что достаточный прирост биомассы обеспечивается наличием доступных для микроорганизмов органических веществ, содержащихся в почве. Образцы инкубировали в тех же условиях, что и в опытах по изучению сорбции. Контролем служили образцы стерильных почвенных суспензий без внесения микроорганизмов-деструкторов.
Фракционированный анализ почвенной суспензии на содержание ГФ проводили через 6 сут инкубирования, когда устанавливалось равновесие между его содержанием в жидкой и твердой фазах и прекращался прирост биомассы интродуцирован-ного штамма.
Титр бактерий-деструкторов определяли путем высева почвенной суспензии на среду MS1 с ГФ.
Во всех экспериментах определения проводили в 3 повторностях, относительная погрешность не превышала 12%, Р = 0.95.
Сс, мг/кг 10000
8000
6000
4000
2000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Ср, мг/л
Рис. 1. Изотермы сорбции глифосата: 1 - ДП, 2 - СЛ почвы. Точки соответствуют полученным экспериментально значениям, а кривые отражают результаты аппроксимации данных с помощью уравнения Фрейндлиха.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сорбция ГФ почвами. Сорбционная способность почв по отношению к загрязнителям обычно описывается изотермой сорбции, которая характеризует распределение поллютанта между твердой и жидкой фазами и дает представление о поглотительной способности почвы. В ряде работ указывается, что ГФ обладает высокой способностью сорбироваться почвами, о чем свидетельствуют значения К: от 17.6 до 60.5 и 1/п от 0.46 до 0.88 [8, 14-16].
Полученные нами кривые изотерм сорбции ГФ исследованными почвами представлены на рис. 1. Обе изотермы удовлетворительно описываются с помощью уравнения Фрейндлиха. Кривые насыщения показывают, что максимальная поглотительная способность ДП и СЛ почв по отношению к ГФ
составляет, соответственно, 3560 и 8200 мг/кг. Значения К и 1/п, полученные путем аппроксимации экспериментальных точек, для ДП почвы составили, соответственно, 15.6 и 0.64, а для СЛ почвы 18.7 и 0.73. Такие низкие значения К для обоих типов почв можно объяснить довольно высоким значением рН почв и низким содержанием в них органического вещества. В то же время повышенное содержание глинистой фракции в СЛ почве объясн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.