=ЗООЛОГИЯ =
УДК 575.174.015.3:599.515
СОСТАВ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЛИНИЙ СЕРЫХ КИТОВ (Eschrichtius robustus) В МОРЯХ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ
© 2015 г. И. Г. Мещерский*, М. А. Кулешова**, Д. И. Литовка***, В. Н. Бурканов****, *****, Р. Д. Эндрюс******, *******, Г. А. Цидулко*, В. В. Рожнов*, В. Ю. Ильяшенко*
*Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 **Московский педагогический государственный университет, кафедра зоологии и экологии,
129164 Москва, ул. Кибальчича, 6 ***Чукотский филиал Тихоокеанского научно-исследовательскогорыбохозяйственного центра,
689000Анадырь, ул. Отке, 56, а/я № 29 ****Камчатский филиал Тихоокеанского института географии ДВО РАН, 683000 Петропавловск-Камчатский, ул. Партизанская, 6 *****National Marine Mammal Laboratory, AFSC, NMFS, NOAA, Seattle, USA 7600 Sand Point Way, NE, Building 4, Seattle, WA, 98115, USA ******University of Alaska, Fairbanks, 905N. Koyukuk Drive, 245O'Neill Building, Fairbanks, Alaska, 99775-7220, USA *******Alaska SeaLife Center, P.O. Box 1329, Seward, AK99664, USA E-mail: molecoldna@gmail.com Поступила в редакцию 28.02.2014 г.
Представлены данные о частотах встречаемости митотипов (контрольный регион и гены цитохрома б и ND2) в группах серых китов, нагуливающихся у побережья Чукотского п-ова, Корякии, восточной части п-ова Камчатка и о-ва Сахалин. Отмечено, что при продвижении с севера на юг число обнаруживаемых митотипов резко снижается, однако в южных выборках продолжают доминировать варианты, широко представленные и в северных районах. Путем сравнения с литературными данными о встречаемости гаплотипов контрольного региона установлено, что в местах размножения китов у п-ова Калифорния может быть представлено разнообразие обеих групп митохондриальных линий, известных для изучаемого вида. Однако показано, что одни и те же последовательности контрольного региона могут входить в состав разных митохондриальных геномов и ограничение анализа только этим участком мтДНК может приводить к неверным результатам.
DOI: 10.7868/S0002332914060071
Серый кит (Eschrichtius гоЪтШн, ЬШуеЪог§, 1861) — представитель отдельного семейства Е8сИг1сЫ;Идае в подотряде усатых китов. Отличительные особенности этого вида — питание бентосом, в связи с чем в нагульный период эти киты придерживаются мелководных прибрежных районов, а также самые протяженные среди млекопитающих миграции к местам размножения. В настоящее время серый кит населяет северную часть Тихого океана, где после разделения мест нагула в постледниковый период (Swartz et а1., 2006) образовались две группировки: восточная (чукотско-калифорнийская) и западная (охот-ско-корейская). Численность первой по принятым Международной китобойной комиссией (МКК) расчетным данным изначально составляла 15—20 тыс., к 1900 г. в результате промысла сократилась до 2.8 тыс., но в результате запрета коммерческого промысла восстановилась и в 1980-х гг. достигала 27 тыс. особей.
Предпромысловая численность западной группировки, основная часть которой размножалась у побережий Кореи и Китая (небольшая часть — у южной оконечности о-ва Хонсю) и нагуливалась в Охотском море, составляла несколько тысяч особей. В последний раз западного серого кита добыли в прибрежных водах Кореи в 1966 г. С этого времени группировку считали исчезнувшей. Однако одиночек, пары и трех китов встречали в прибрежных водах Японии и в Охотском море до 1980-х гг., позже встречали группы от 4 до 34 особей (Маминов, Блохин, 2004; №шЪи et а1., 2010). К началу 2000-х гг. эту группировку включили в Красный список Международного союза охраны природы с категорией "исчезающая популяция" (ЯеШу etа1, 2013). В настоящее время ее численность оценивают 150—180 особями.
Однако изоляция западной и восточной группировок неоднократно подвергалась сомнению (Nishiwaki, Ка8иуа, 1970; Ошига, 1974). Встречи серых китов в последние годы в море Лаптевых
(Шпак и др., 2013), у архипелага Земля Франца-Иосифа, в Средиземном море и у побережья Намибии позволили выдвинуть гипотезу о начале восстановления исторического ареала этого вида, в том числе о заселении мест обитания вымершей западной группировки особями, мигрирующими из восточной (Ильяшенко, 2012).
Анализ генетического разнообразия серых китов восточной группировки как непосредственно на зимовках у берегов п-ова Калифорния, так и в расположенных севернее районах проведен в ряде публикаций (Steeves et al., 2001; Goerlitz et al., 2003; Alter, Palumbi, 2009; Alter et al., 2009, 2012). В то же время данные по группам китов, мигрирующих вдоль побережий России, представлены в научной литературе крайне скудно (LeDuc et al., 2002). Несмотря на большой объем работ, проведенных в данном направлении в последние годы, полученные результаты остаются неопубликованными.
Цель работы — проанализировать полученные нами данные о встречаемости митохондриальных линий серых китов в дальневосточных морях у побережья России.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использованы образцы ткани серых китов, добытых в рамках аборигенного промысла на Чукотском п-ове в р-не сел Лорино, Сиреники, Но-во-Чаплино, Янракыннот и Лаврентия (далее — Чукотка) в 2001 (14 особей), 2003 (13 особей), 2004 (18 особей), 2005 (17 особей), 2007 (10 особей), 2008 (б особей) и 2010 гг. (34 особи).
Также использованы образцы кожи, собранные методом дистанционной биопсии (по разрешениям Росприроднадзора) в водах следующих районов:
вдоль Корякского побережья на участке от м. Олюторский до устья р. Хатырка (м. Игла, бух. Дежнева, устье р. Хатырка (далее — Корякия) в июне—августе 2010 г. (21 образец);
вдоль восточного побережья Камчатки (бухты Каменистая, Ольга, Асача и Авачинский зал. (далее — Камчатка) летом 2004 (3 образца), 2010 (20 образцов) и 2011 гг. (1 образец);
в водах у о-ва Сахалин у зал. Пильтун (далее — Сахалин) летом 2010 (9 образцов) и 2011 гг. (13 образцов).
Образцы сохраняли в 20%-ном растворе диме-тилсульфоксида (ДМСО) в насыщенном растворе поваренной соли или в этиловом спирте.
Тотальную ДНК выделяли с использованием набора InviMag Tissue DNA Mini Kit/ KF96 (STRATEC Molecular, Германия) на процессоре магнитных частиц KingFisher Flex /96 (Thermo Fisher Scientific, Финляндия).
Для определения состава нуклеотидных последовательностей были амплифицированы следующие участки митохондриальной ДНК (мтДНК):
контрольный регион — с использованием праймеров MT4 [5'-cctccctaagactcaaggaag-3'] и H00034 [5'-taccaaatgtatgaaacctcag-3'], как описано ранее (LeDuc et al., 2002), при температуре отжига 54°С;
ген цитохрома b — с использованием праймеров cet_cbF [5'-aatgacatgaaaaatcatcgtt-3'] и cet_cbR [5'-ctccttttccggtttacaa-3'] при температуре отжига 52°С;
ген второй субъединицы НАДФ-дегидрогена-зы (ND2) — с использованием праймеров cet_nd2_F [5'-cataccccgaaaatgttggt-3'] и cet_nd2_R [5'-tagggctttgaaggctcttg-3'].
При проведении терминирующих реакций были использованы эти же праймеры, а при определении последовательности гена цитохрома b также внутренние праймеры cet_cb_intF [5'-gaaacat-tggggtaatcctactat-3'] и cet_cb_intR [5'-gtttgctgggg-tgtagttatc-3'].
Дизайн оригинальных праймеров был выполнен с использованием программы Primer3 (Ro-zen, Skaletsky, 2000). Все полимеразно-цепные реакции (ПЦР) проводили на базе смесей MagMIX 2025 (ПКЗАО "Диалат", Россия), праймеры были синтезированы НПК СИНТОЛ (Россия). Терминирующие реакции проводили с использованием набора BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, США), последовательности определяли на секвенаторах моделей 3130 и 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Проверку качества автоматической расшифровки хроматограмм, совмещение прямых и обратных индивидуальных последовательностей, их выравнивание и хранение осуществляли в программе BioEdit (Hall, 1999).
Половую принадлежность особей определяли одновременной амплификацией участков X и Y хромосом (Jayasankar et al., 2008) с использованием флуоресцентно-меченных праймеров. Результаты реакции визуализировали на секвенаторе в присутствии размерного стандарта для контроля соответствия длин получаемых фрагментов ожидаемым.
Для оценки уникальности образцов, собранных методом биопсии в течение одного сезона и совпавших по половой принадлежности и последовательности контрольного региона мтДНК, проведено генотипирование по пяти микросател-литным локусам (DlrFCB5, DlrFCB17, Ev94Mn, 417/418, 464/465) по методике, описанной ранее (Мещерский и др., 2013). При совпадении всех пяти генотипов образец считался дублирующим. Возможность принадлежности к одной и той же особи образцов, собранных в разных районах, не определялась исходя из положения, что каждая выборка характеризует состав линий, встречаю-
Рис. 1. Медианная сеть митотипов серого кита (2802 п. н.), построенная методом Median Joining. Диаметр кружка соответствует частоте встречаемости митотипа в общей, а размер сектора — в региональной выборке. 1 — гаплотипы, отмеченные на Чукотке, 2 — на Корякском побережье, 3 — на Камчатке, 4 — на Сахалине. В скобках указано число измененных позиций, разделяющих митотипы 2 и 16, в остальных случаях минимальное расстояние между кружками пропорционально одной измененной позиции. А1, А2 и В — митогруппы.
щихся в конкретных районах, вне зависимости от индивидуальной принадлежности особей.
Для обработки полученных результатов использовали программы Arlequin v.3.1 (Excoffier et al., 2005), Network 4.6.0.0 (Bandelt et al., 1999) и MEGA v.5.2.2 (Tamura et al, 2011).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для мтДНК особей из состава исследованной выборки отмечено 10 гаплотипов (вариантов) последовательности гена цитохрома б (1137 пар нук-леолтидов (п. н.), полная последовательность, за исключением стоп-кодона), 9 гаплотипов гена ND2 (1044 п. н., полная последовательность) и 37 гаплотипов контрольного региона (участок, включающий в себя 65 п. н. гена tRNA-Pro и 555— 556 п.н. собственно контрольного региона мтДНК). Последовательности депонированы в базе данных GenBank под номерами KJ865243— KJ865298. В пределах единого митохондриально-го генома указанные последовательности объе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.